新的致癌基因CSF3R突變對(duì)慢性中性粒細(xì)胞白血病影響的研究.pdf

1、新的致癌基因CSF3R突變對(duì)慢性中性粒細(xì)胞白血病影響的研究
　　本文主要研究一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的基因—粒細(xì)胞集落刺激因子受體（CSF3R），它的突變尤其是突變位點(diǎn)CSF3R-T618I，以及我們首次報(bào)道的突變位點(diǎn)CSF3R-H54A對(duì)慢性中性粒細(xì)胞白血病的分子發(fā)病機(jī)理的影響。
　　第一部分.病例報(bào)告
　　慢性中性粒細(xì)胞白血病伴EVI-1基因高表達(dá)和CSF3R、SETBP1基因突變
　　背景：慢性中性粒細(xì)胞白血病（CNL）

2、是一種罕見的骨髓增殖性腫瘤（MPN），表現(xiàn)為持續(xù)的中性粒細(xì)胞增多，脾腫大，骨髓粒系增生而不伴有明顯的發(fā)育異常，費(fèi)城（Ph）染色體陰性。我們的病例特點(diǎn)是伴有顯著和持續(xù)的中性粒細(xì)胞增多，NAP積分值增高，Ph染色體及BCR-ABL融合基因陰性，并排除導(dǎo)致類白血病反應(yīng)的潛在疾病。在我們的病例中，初次接診病人并無肝脾腫大，但其他的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果滿足WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)。一年后患者由于疾病進(jìn)展，出現(xiàn)牙齦出血，脾腫大，淋巴結(jié)腫大。該患者在臨床治療過程中外

3、周血細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均值如下：白細(xì)胞28.36×109/L（范圍7.67-51.28 X109/L），成熟中性粒細(xì)胞占88.5％（范圍78.8-98.5％），血小板33.3×109/L（范圍23-94×109/ L）。在治療的過程中，患者出現(xiàn)了血小板減少癥，并逐漸對(duì)羥基脲和IFN-α治療反應(yīng)不佳。材料/方法：收集該CNL患者的外周血，利用Ficoll梯度密度分離方法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞（PMNCs），并將其置于完全培養(yǎng)基，37℃，5％CO2

4、的溫箱中培養(yǎng)。利用LSR II流式細(xì)胞儀檢測(cè)中性粒細(xì)胞的功能，如細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移能力。將中性粒細(xì)胞置于含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)，收集細(xì)胞并用Annexin V和PI（BD Pharmingen公司）標(biāo)記，檢測(cè)細(xì)胞凋亡與正常對(duì)照組的差異。將純化的中性粒細(xì)胞培養(yǎng)在transwell小室（1×106/孔），并且將趨化肽N-甲?；琢虬滨Ａ涟滨１奖滨＃╢MLP,1uM，SIGMA）加入到下室中。在

5、每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，我們計(jì)數(shù)下室的中性粒細(xì)胞數(shù)量，檢測(cè)中性粒細(xì)胞的遷移能力。通過FACSAria III（BD Biosciences公司）流式細(xì)胞儀分別分選CD34+和CD15+的細(xì)胞，利用基于PCR的DNA焦磷酸測(cè)序方法檢測(cè)致癌基因CSF3R整個(gè)外顯子和內(nèi)含子的突變情況。
　　結(jié)果：該病人的成熟中性粒細(xì)胞占93.9％。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，該患者的中性粒細(xì)胞96h后仍然存活，而正常對(duì)照組中的中性粒細(xì)胞在72h后僅少量存

6、活。細(xì)胞周期結(jié)果顯示正常，提示所有的細(xì)胞都發(fā)生終末分化，而沒有細(xì)胞分裂。實(shí)驗(yàn)組中性粒細(xì)胞對(duì)由fMLP誘導(dǎo)的的遷移活性明顯低于正常對(duì)照細(xì)胞，但比正常陰性對(duì)照更高（不含fMLP）。有趣的是，我們通過定性檢測(cè)方法觀察到EVI-1基因陽性。我們還分選了CD34+、CD15+的細(xì)胞以及骨髓細(xì)胞，3次通過熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)EVI-1基因的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，這些定量結(jié)果相似，尤其是骨髓細(xì)胞和CD34+細(xì)胞EVI-1基因均高表達(dá)，而CD15

7、+的細(xì)胞EVI-1基因陽性，但其表達(dá)水平較低。
　　該病人CD34+和CD15+的細(xì)胞的CSF3R膜近端第14個(gè)外顯子存在T618I突變。此外，我們還發(fā)現(xiàn)CSF3R第4外顯子存在H54A的雜合突變。我們還擴(kuò)增了體細(xì)胞SETBP1基因，并對(duì)其第3個(gè)外顯子706-917之間的密碼子進(jìn)行測(cè)序，評(píng)估SETBP1基因突變情況。我們的結(jié)果顯示該患者體細(xì)胞SETBP1基因存在雜合突變（2602C>A），導(dǎo)致868位的天冬氨酸突變?yōu)樘於０贰?b

8、r>　　結(jié)論：該患者為67歲的老年男性，表現(xiàn)為持續(xù)的中性粒細(xì)胞增多和血小板減少，不存在BCR-ABL1融合基因和JAK2基因V617F突變，伴EVI-1基因過度表達(dá)和CSF3R和SETBP1并發(fā)突變。我們首次發(fā)現(xiàn)CSF3R-H54A突變位點(diǎn)，并最終診斷為CNL。我們接下來的研究將進(jìn)一步闡釋突變位點(diǎn)對(duì)CNL的分子發(fā)病機(jī)理的影響。
　　第二部分
　　CSF3R基因突變位點(diǎn)對(duì)CNL克隆優(yōu)勢(shì)的作用研究
　　目的：檢測(cè)CSF3R

9、-FL、CSF3R-T618I和CSF3R-H54A突變對(duì)CNL的分子發(fā)病機(jī)制的影響
　　材料/方法：
　　1.質(zhì)粒構(gòu)建:使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法擴(kuò)增插入物，限制性酶切和連接構(gòu)建質(zhì)粒。過程概括如下：宿主載體pLV-EF1α-EYFP-N,pLP-2,pVSV-G,pLP-1利用試劑盒（Omegabio-tek maxi prep kit）純化，并通過限制性內(nèi)切酶（ECORI，NOTI）酶切。利用DNA提取試劑盒（AxyPre

10、p TM DNAGel Extraction Kit）對(duì)瓊脂糖凝膠中的線性化的載體進(jìn)行純化，樣品濃度的估測(cè)參照溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠上的DNA Maker。所有插入物（CSF3R-FL，CSF3R-T618I，CSF3R-H54A）通過PCR擴(kuò)增獲得。擴(kuò)增的DNA片段使用DNA提取試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收純化，并通過ECO RI，NOTI酶切使載體線性化。酶切反應(yīng)如下：i)插入體系（反應(yīng)總體積40μl）：100-3000ng純化的PC

11、R產(chǎn)物，適量的消化酶，10×反應(yīng)緩沖液4μl，置于適當(dāng)?shù)臏囟冗^夜反應(yīng)；ⅱ）載體體系（反應(yīng)總體積20μl）：2000-4000ng質(zhì)粒DNA，適量的消化酶，10×反應(yīng)緩沖液2μl，適當(dāng)?shù)臏囟认路磻?yīng)4小時(shí)。必要時(shí)將酶切的片段再次純化，插入物的濃度評(píng)估方法同上。將載體：插入物按1:3的摩爾比加入體系用于連接反應(yīng)。將連接反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞DH5α大腸桿菌，并置于含氨芐青霉素（Sigma公司）的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)。一天后挑取單菌落，接

12、種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。質(zhì)粒從上述過夜培養(yǎng)物中純化，并通過限制性圖譜測(cè)試插入體的存在與否。所選克隆用Sanger方法測(cè)序。
　　2.慢病毒包裝：我們的系統(tǒng)包括了3種主要成分，如慢病毒表達(dá)載體（CSF3R-FL和CSF3R-T618I質(zhì)粒DNA），慢病毒包裝質(zhì)粒（pLP-1，pLP-2，pVSV-G），293TN細(xì)胞。我們將1×105個(gè)293TN細(xì)胞接種到10cm2培養(yǎng)皿中，加入2-3ml含4mM L-谷氨酰胺、

13、4.5 g/l葡萄糖和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的溫箱中培養(yǎng)18-24h。當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)到60%～80%時(shí)用于轉(zhuǎn)染。我們利用綠色熒光蛋白（GFP）作為陽性對(duì)照，來證實(shí)轉(zhuǎn)染成功與否。再收集含感染性假病毒顆粒的培養(yǎng)基上清液。
　　3.將假病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)到小鼠骨髓原始細(xì)胞：我們利用 MethoCultTM培養(yǎng)基進(jìn)行小鼠骨髓細(xì)胞集落培養(yǎng)，用于評(píng)估CNL相關(guān)的致癌基因?qū)π∈蠊撬柙技?xì)胞的形態(tài)和數(shù)量的影響。其中，我們

14、設(shè)立了不含病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和不表達(dá)目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的對(duì)照組(CSF3R-FL，CSF3R-T618I)。
　　結(jié)果：
　　1、我們成功提取和純化了含CSF3R-FL和CSF3R-T618I重組質(zhì)粒的克隆，但未獲得CSF3R-H54A重組質(zhì)粒的克隆。
　　2、轉(zhuǎn)染293TN細(xì)胞24h后，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白。
　　3、CSF3R兩種克隆均能轉(zhuǎn)導(dǎo)到小鼠集落形成細(xì)胞，于接種7天后顯微鏡下計(jì)數(shù)CFU-GM克隆，其中膜近端突

15、變T618I轉(zhuǎn)導(dǎo)的粒單-集落形成單位（CFU-GM）計(jì)數(shù)多于全長(zhǎng)非突變株（CSF3R-FL），提示CSF3R-T618I突變有利于CNL白血病細(xì)胞的克隆。
　　結(jié)論：
　　1、質(zhì)粒構(gòu)建、病毒包裝和小鼠骨髓細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)均順利完成。
　　2、我們證實(shí)了CSF3R突變的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，并發(fā)現(xiàn)CSF3R-T618I轉(zhuǎn)導(dǎo)能力強(qiáng)于CSF3R-FL。該結(jié)果表明CSF3R-T618I突變有利于CNL白血病細(xì)胞的克隆。
　　3、我們