炎癥相關性結(jié)腸癌小鼠模型的建立及紅木生育三烯酚對其外周血T淋巴細胞和細胞因子的影響.pdf

1、目的:
　　本研究通過化學誘導劑氧化偶氮甲烷（AOM）聯(lián)合葡聚糖硫酸鈉鹽（DSS）建立炎癥相關性結(jié)腸癌小鼠模型，為后續(xù)實驗研究奠定動物模型基礎，同時初步探究紅木生育三烯酚對結(jié)腸癌小鼠外周血T淋巴細胞、IL-6、IFN-γ的影響。
　　方法:
　　1. AOM-DSS誘導的炎癥相關性結(jié)腸癌小鼠模型的建立實驗動物按體重隨機均分為4組，每組15只，溶劑對照組、DSS低分子量組、DSS高分子量組和DSS低分子量+DSS高分子量

2、組。結(jié)腸癌造模動物腹腔注射氧化偶氮甲烷 AOM（10mg/kg.BW）一次，一周后給予含3％致炎劑葡聚糖硫酸鈉（DSS）蒸餾水連續(xù)飲用7天，換蒸餾水連續(xù)飲用14天，含2％DSS蒸餾水連續(xù)飲用5天，蒸餾水連續(xù)飲用16天，含2％DSS蒸餾水連續(xù)飲用5天，蒸餾水連續(xù)飲用。溶劑對照組腹腔注射與 AOM同體積生理鹽水，連續(xù)飲用蒸餾水直至造模第20周結(jié)束。
　　每天觀察并記錄動物毛發(fā)、糞便性狀及是否出現(xiàn)肉眼可見血便，每周記錄動物體重1次。造模

3、第20周結(jié)束時摘眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，取動物脾臟稱量并記錄臟器系數(shù)。取由肛門至盲腸末端的全部結(jié)直腸，沿結(jié)腸帶垂直剖開直結(jié)腸，用生理鹽水沖洗后觀察腸道內(nèi)病變情況，計數(shù)腫瘤形成個數(shù)， HE染色觀察動物結(jié)腸組織和脾組織的病理學改變。
　　2.紅木生育三烯酚對AOM-DSS誘導的結(jié)腸癌小鼠外周血T淋巴細胞和細胞因子的影響將實驗動物按體重隨機均分為5組，每組15只，包括1個溶劑對照組和4個結(jié)腸癌造模組，結(jié)腸癌造模組又分別包括腫瘤模型對

4、照組、低劑量紅木生育三烯酚組、中劑量紅木生育三烯酚組和高劑量紅木生育三烯酚組。溶劑對照組和腫瘤模型組每天經(jīng)口給予大豆油灌胃0.1mg/kg.BW，低、中、高生育三烯酚實驗組分別經(jīng)口灌胃給予δ-生育三烯酚當量為5mg/kg.BW、10mg/kg.BW、20mg/kg.BW的紅木生育三烯酚。
　　實驗動物灌胃1周后，結(jié)腸癌造模組動物腹腔注射氧化偶氮甲烷（AOM）10mg/kg.BW一次，一周后給予3％致炎劑葡聚糖硫酸鈉（DSS分子量為

5、36000-50000MW）連續(xù)飲用7天，換蒸餾水連續(xù)飲用14天，2％DSS連續(xù)飲用5天，蒸餾水連續(xù)飲用16天，2％DSS連續(xù)飲用5天，蒸餾水連續(xù)飲用。溶劑對照組腹腔注射AOM同體積生理鹽水，連續(xù)飲用蒸餾水直至造模第20周結(jié)束。每天觀察動物毛發(fā)、糞便性狀及是否出現(xiàn)肉眼可見血便并記錄，每周記錄動物體重1次。造模第20周結(jié)束時摘眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，取動物組織（胸腺、肝臟、雙腎、脾臟）稱量并記錄臟器系數(shù)。
　　取由肛門至盲腸末端

6、的全部結(jié)直腸，沿結(jié)腸帶垂直剖開直結(jié)腸，用生理鹽水沖洗后觀察腸道內(nèi)病變情況，計數(shù)腫瘤形成個數(shù)，HE染色觀察動物結(jié)腸組織和脾組織的病理學改變。
　　全自動血液分析儀測定全血血液學指標；流式細胞儀檢測外周血 CD4+T細胞、CD8+T細胞及CD4+T與CD8+T比率；ELISA方法檢測外周血細胞因子IL-6、IFN-γ的含量。
　　結(jié)果:
　　AOM-DSS誘導炎癥相關性結(jié)腸癌小鼠模型的建立：
　　1.小劑量、單次腹腔

7、注射AOM（10mg/kg.BW）聯(lián)合2-3%DSS（分子量為36000-50000MW）飲水，3個循環(huán)，20周后，可以誘導CD-1(ICR)小鼠腸粘膜增厚、皺襞紊亂，結(jié)腸遠端腫瘤生長，并且腫瘤形成率為100%。
　　2. AOM/DSS模型誘導小鼠腸粘膜出現(xiàn)不同程度的增厚，皺襞紊亂，可觀察到個數(shù)不等大小不一的結(jié)直腸腫瘤生長。肉眼可見生成的腫瘤向腸腔內(nèi)突出，部分小腫瘤相互融合成大腫瘤，形成腫瘤數(shù)量多時腫瘤相互連接，形成片狀。HE染

8、色，鏡下病理觀察結(jié)果顯示，黏膜層及黏膜下層出現(xiàn)廣泛的炎癥細胞浸潤；層內(nèi)可觀察到腺管樣結(jié)構(gòu)，具有組織異型性；腺體組織結(jié)構(gòu)紊亂、被破壞。形成的腫瘤包括從低級別上皮內(nèi)瘤變到高級別上皮內(nèi)瘤變的病理改變，且腫瘤的發(fā)展全部在原位癌階段，未見浸潤性癌的形成。
　　3. AOM/DSS模型小鼠脾腫大，脾臟系數(shù)增大。HE染色可見多核巨細胞增多，紅髓消失，髓外造血。紅木生育三烯酚對AOM-DSS誘導的結(jié)腸癌小鼠外周血T淋巴細胞和細胞因子的影響：

9、>　　1.腫瘤模型對照組小鼠平均體重低于溶劑對照組，且在給予DSS飲水后平均體重較前一周有降低趨勢。5mg/kg.BW、10mg/kg.BW、20mg/kg.BW紅木生育三烯酚組小鼠平均體重高于腫瘤模型對照組，低于溶劑對照組。
　　2.腫瘤模型對照組白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、紅細胞比積、血小板、嗜酸性粒細胞與溶劑對照組相比下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。5mg/kg.BW生育三烯酚組白細胞計數(shù)、中性粒細胞與溶劑對照

10、組相比下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。10mg/kg.BW、20mg/kg.BW紅木生育三烯酚組白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、與溶劑對照組相比下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　3.10mg/kg.BW、20mg/kg.BW紅木生育三烯酚組能顯著提高結(jié)腸癌小鼠外周血CD4+/CD8+比率；20mg/kg.BW紅木生育三烯酚組能顯著提高結(jié)腸癌小鼠外周血IFN-γ表達量；10mg/kg.BW、20mg/kg.BW紅木生育三

11、烯酚組能顯著降低結(jié)腸癌小鼠外周血 IL-6表達量，與腫瘤模型對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.小劑量（10mg/kg.BW）、單次腹腔注射AOM聯(lián)合2-3%DSS（分子量36000-50000MW）飲水3個循環(huán)，20周后，可以成功誘導CD-1(ICR)小鼠發(fā)生結(jié)腸腫瘤，并且腫瘤形成率為100%。
　　2.紅木生育三烯酚能調(diào)節(jié)腫瘤相關免疫細胞和細胞因子的表達，改善AOM/DSS誘導的結(jié)腸