氟對大鼠長骨縱向生長的影響及其病理學(xué)改變.pdf

1、氟是一種必需微量元素，適量的氟能促進(jìn)骨骼的生長，然而大劑量攝入可引起氟中毒[1，2]。地方性氟中毒，是一種與環(huán)境中氟濃度密切相關(guān)的地方性疾病，主要包括飲水型、燃煤污染型和飲磚茶型氟中毒[3]。我國是地方性氟中毒的高發(fā)區(qū)，其主要臨床表現(xiàn)為氟斑牙和氟骨癥。生長板軟骨損傷是地氟病的主要癥狀之一，生長板是軟骨內(nèi)成骨的主要作用部位，軟骨內(nèi)成骨在脊椎動物長骨的發(fā)育過程中尤為重要。
　　軟骨內(nèi)成骨的過程表現(xiàn)為軟骨生長板，即骺板軟骨細(xì)胞增殖、肥大

2、、凋亡，血管侵入，新骨沉積，形成骨干的縱向生長的過程，這一有序過程直到成年才結(jié)束。幼年時期軟骨的增生、退化的速率與新骨生成的速率持平，保證在骨干長度增加的同時，生長板可以保持一定的厚度;當(dāng)軟骨生長板發(fā)育到成熟階段，軟骨增殖與成骨活性中止，生長板閉合，骨的縱向生長也隨之停止[4]。因此，軟骨內(nèi)成骨在骨的發(fā)育過程中尤為重要，可調(diào)節(jié)控制骨的縱向生長速度及骨的最終長度。
　　目的:
　　研究發(fā)現(xiàn)氟中毒影響軟骨內(nèi)成骨的過程，我們的動物

3、實驗初步發(fā)現(xiàn)染氟大鼠的脛骨變短，生長板增厚，進(jìn)一步證實過量氟的確可以抑制軟骨內(nèi)成骨的過程。軟骨內(nèi)成骨受局部因素和全身因素的共同作用，因此本實驗首先建立大鼠模型，通過測量大鼠的體長、脛骨及股骨的長度來觀察氟對長骨生長發(fā)育的影響;之后建立體外培養(yǎng)的大鼠跖骨模型，觀察不同染氟濃度及不同染氟時間對跖骨縱向生長的影響，并檢測跖骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)以及軟骨細(xì)胞增殖、分化、凋亡指標(biāo)的變化，探討氟是否會影響大鼠長骨的生長發(fā)育及是否對軟骨內(nèi)成骨的過程產(chǎn)生

4、直接的損害作用。
　　方法:
　　一、實驗方法
　　1、動物分組、染氟及一般情況的測量
　　斷乳一周SD雄性大鼠（中國醫(yī)科大學(xué)動物部提供）40只，按體重隨機分組，分別給予含0 mg/L、50 mg/L、100 mg/、150 mg/L F-的蒸餾水連續(xù)喂養(yǎng)12周，記錄觀察期始末大鼠體長的變化情況，并于實驗周期結(jié)束后測量大鼠脛骨、股骨的長度。
　　2、新生大鼠跖骨體外器官培養(yǎng)模型的建立
　　取新生SD大

5、鼠第2、3、4跖骨，培養(yǎng)于αMEM培養(yǎng)基(含0.2％胎牛血清蛋白、0.05 mg/ml維生素C、1mmol/Lβ甘油磷酸鈉及不同濃度F-)，在5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)7天。
　　3、跖骨總長度、礦化區(qū)長度的測量
　　培養(yǎng)的第0、7天通過實體顯微鏡10×0.3×63倍下采集并測量不同濃度F-培養(yǎng)的跖骨總長度及礦化區(qū)長度;第1、4、7天采集并測量10-4M F-培養(yǎng)的跖骨總長度及礦化區(qū)長度，并計算相對縱向生長率。
　　

6、4、跖骨組織石蠟切片的制備
　　10-4M F-培養(yǎng)7天的跖骨組織經(jīng)4％PFA固定、10％EDTA脫鈣、不同梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟進(jìn)行包埋，制作5μm石蠟切片。
　　5、跖骨組織的甲苯胺藍(lán)染色
　　石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水后用0.1％甲苯胺藍(lán)染色30s，再經(jīng)鹽酸酒精分化、二甲苯脫水，天然中性樹膠封片后于顯微鏡下觀察拍照。
　　6、跖骨組織的免疫組織化學(xué)染色
　　石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水后經(jīng)免疫組化法檢測

7、跖骨組織中COLⅡ、COL X蛋白的表達(dá)情況。
　　7、跖骨組織的TUNEL法染色
　　石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水后按MK1020細(xì)胞凋亡檢測試劑盒Ⅰ(POD)說明書進(jìn)行TUNEL法染色，檢測跖骨組織中軟骨細(xì)胞的凋亡情況。
　　二、統(tǒng)計學(xué)處理
　　全部數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（(x)±s）表示，大鼠組間差異性比較采用單因素方差分析法、LSD多重比較法;跖骨氟處理前后差異性比較采用Paired

8、-Samples t-test法。以P＜0.05（*）或P＜0.01（**）為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、氟對大鼠體長、脛骨及股骨的影響
　　與對照組、低劑量組相比，中、高劑量組大鼠體長顯著降低(P＜0.01);與對照組相比，高劑量組大鼠脛骨、股骨長度顯著降低(P＜0.05);與低劑量組相比，中、高劑量組大鼠股骨長度也顯著降低(P＜0.01)。
　　2、跖骨體外培養(yǎng)模型的建立
　　新生大鼠跖骨在

9、未破壞骨膜的前提下分離后于無菌培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)的第0、7天測量跖骨總長度、礦化區(qū)長度，長度均增加，表明跖骨體外培養(yǎng)模型建立成功。
　　3、不同染氟濃度對跖骨總長度、跖骨礦化區(qū)長度的影響
　　10-7M F-組跖骨總長度的縱向生長率與對照組相比無差別，10-6M F-組略高于對照組，10-5M F-組開始與對照組相比降低，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;10-4 M F-組顯著低于對照組（P＜0.05）。
　　10-7 M F-

10、組的跖骨礦化區(qū)縱向生長率略高于對照組，10-6、10-5MF-組的低于對照組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;10-4 M F-組顯著低于對照組(P＜0.01)。
　　4、不同染氟時間對跖骨總長度、礦化區(qū)長度的影響
　　10-4 M F-組跖骨總長度的縱向生長率在培養(yǎng)的第1、4天略低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;培養(yǎng)第7天發(fā)現(xiàn)染氟組生長率顯著低于對照組(P＜0.05)。
　　10-4 M F-組跖骨礦化區(qū)長度的縱向生長率在培養(yǎng)的

11、第1天略低于對照組，差異未見統(tǒng)計學(xué)意義;培養(yǎng)第4、7天發(fā)現(xiàn)染氟組生長率顯著低于對照組(P＜0.01)。
　　5、氟對體外培養(yǎng)的大鼠跖骨組織形態(tài)計量學(xué)影響
　　10-4MF-組靜息層、增殖層、肥大層厚度均顯著低于對照組(P＜0.01);
　　10-4 M F-組靜息層&增殖層與肥大層的比值與對照組相比顯著升高(P＜0.01)。
　　6、免疫組織化學(xué)染色法檢測COLⅡ、COL X在大鼠跖骨軟骨細(xì)胞的表達(dá)情況
　

12、　10-4MF-組跖骨靜息層、增殖層、肥大層軟骨細(xì)胞COLⅡ的染色較對照組淺;10-4MF-組增殖層、肥大層軟骨細(xì)胞COL X的染色較對照組淺。
　　7、TUNEL法檢測過量氟對體外培養(yǎng)的大鼠跖骨軟骨細(xì)胞凋亡情況的影響
　　10-4M F-組跖骨生長板全層軟骨細(xì)胞的凋亡的陽性表達(dá)均強于對照組;生長板全層的凋亡指數(shù)顯著高于對照組(P＜0.05);靜息層10-4MF-組軟骨細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯高于對照組(P＜0.05);增殖層、肥