飽和富氫液對糖尿病神經(jīng)病變的保護作用及機制研究.pdf

1、富氫液對糖尿病神經(jīng)病變的影響及相關機制研究
　　糖尿病神經(jīng)病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一。大量研究表明，氧化應激反應、炎癥因子釋放以及細胞的凋亡在糖尿病神經(jīng)病變中起重要作用。目前，對于糖尿病神經(jīng)病變尚無有效的防治措施!近年眾多研究表明，低濃度氫分子(<4％)及富氫液具有選擇性抗氧化、抗炎、抗凋亡作用，并已證明可應用于多種疾病動物模型的治療，如：臟器的缺血/再灌注損傷、神經(jīng)退行病變、膿毒血癥等。因此，越來越多的學者認為氫氣與富氫液

2、是一種新型的醫(yī)學氣體分子。本課題利用離體高糖培養(yǎng)的雪旺細胞(RSC96)和在體糖尿病大鼠模型，探討富氫液對糖尿病神經(jīng)病變保護作用的可能機制，為臨床治療奠定基礎。
　　實驗一、
　　富氫液對高糖誘導雪旺細胞損傷的影響
　　目的：高血糖誘發(fā)的氧化應激、炎癥反應以及導致的雪旺細胞的凋亡在糖尿病神經(jīng)病變的病理生理過程中具有重要意義。富氫液具有選擇性抗氧化、抗炎、抗凋亡作用。本實驗擬利用高糖培養(yǎng)下的雪旺細胞(RSC96)，探討富

3、氫液對于高糖培養(yǎng)的雪旺細胞影響。
　　方法：
　　大鼠永生化雪旺細胞株(RSC96細胞)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，接種于6孔或96孔細胞培養(yǎng)板，3 mL/孔或200μL/孔，細胞密度2×l06/mL。
　　第一部分：不同濃度高糖誘導下對雪旺細胞的影響，體外培養(yǎng)的雪旺細胞分為5組(n=30)：正常對照組(5.6mmol/L)和高糖組(25 mmol/L、50mmol/L、100mmol/L)、甘露醇組，分別

4、于培養(yǎng)24h、48h、72h應用MTT(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法)法檢測高糖對RSC96細胞增殖的影響；同時應用酶聯(lián)免疫法檢測炎癥細胞因子(IL-1β，HMGBl)、氧化應激產(chǎn)物(MDA、8-羥基脫氧鳥苷)變化情況。
　　第二部分：富氫培養(yǎng)液對高糖培養(yǎng)的雪旺細胞影響。
　　1.體外培養(yǎng)的RSC96雪旺細胞接種于培養(yǎng)皿培養(yǎng)48 h，采用隨機數(shù)字表法將細胞分為6組(n=6)：正常對照(Con)組、高糖(HG)組(根據(jù)第一部

5、分實驗結果，50mmol/L高糖組入選)、富氫水(HS)組、HG+HS(0.15/0.30/0.60mmol/L)組，細胞培養(yǎng)采用正常培養(yǎng)液與不同濃度的含氫培養(yǎng)液培養(yǎng)，給予或不給予高糖處理，48 h后收集細胞培養(yǎng)液，應用MTT法檢測各組細胞增殖情況。
　　2.探討飽和富氫培養(yǎng)液對于高糖所致雪旺細胞氧化應激、炎癥反應以及凋亡的作用。實驗分為三組(n=6)：正常對照(Con)組、高糖(HG)組、HG+HS(根據(jù)第二部分實驗，0.60m

6、mol/L組入選)。對照組培養(yǎng)基含糖5.6mmol/L，HG組含糖50 mmol/L，HG+HS組為含有0.6mmol/L氫分子的高糖培養(yǎng)基。48h末，進行超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量；Elisa法測定炎癥因子IL-6、HMGBl的水平；流式細胞儀檢測細胞凋亡情況；Western blot法檢測細胞活化的半胱氨酸天冬氨酸酶3(Caspase-3)表達水平。觀察含氫培養(yǎng)液對高糖誘導的雪旺細胞的損傷(氧化應激、炎癥反應以

7、及細胞凋亡)的影響。
　　結果：
　　第一部分：
　　1.與Con組細胞相比，在24h、48h、72h末高糖處理組的氧化應激產(chǎn)物MDA、8-OHDG，細胞促炎癥因子的釋放均明顯增加，但在48h更為明顯；甘露醇組細胞無明顯變化；
　　2.MTT法檢測結果表明，與對照組細胞相比在24h、48h、72h末，高糖處理組成活細胞數(shù)量少、死亡率高，且在48h末最為明顯(P＜0.05)。
　　3.與對照組相比較，在高糖處

8、理組中50mmol/L組，氧化應激產(chǎn)物生成、炎癥因子釋放、細胞死亡率升高更為明顯(P＜0.05)。
　　4. Con組與甘露醇組相比，上述指標無明顯差異(P＞0.05)。氧化應激反應、炎癥因子的釋放參與高糖誘導雪旺細胞增殖，影響細胞的活力；各高糖處理組在48h時對體外培養(yǎng)雪旺細胞損傷最為嚴重，其中50mmol/L高糖培養(yǎng)基損傷最為嚴重。
　　第二部分：MTT法結果表明：給予不同濃度的含氫培養(yǎng)液處理對于正常培養(yǎng)液雪旺細胞的增殖

9、活力無明顯影響(P＞0.05)；給予不同濃度的含氫培養(yǎng)液處理均可以顯著降低含高糖培養(yǎng)基對于雪旺細胞的損傷，且0.60mmol/L的含氫培養(yǎng)液作用效果明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與Con組相比，HG和HG+HS組SOD活性下降，炎癥因子釋放(IL-6與HMGBl)，MDA含量、細胞內(nèi)活化的caspase-3蛋白以及凋亡的雪旺細胞數(shù)目表達均明顯升高(P＜0.05)；與高糖組比較，HG+HS組細胞活力升高，SOD活性升高，MDA

10、含量減少，IL-6、HMGB-l水平、細胞凋亡數(shù)目以及細胞內(nèi)活化的Caspase-3蛋白表達均明顯降低(P＜0.05)。結論：給予不同濃度的含氫培養(yǎng)液處理均可以抑制氧化應激反應的損傷；降低促炎癥因子的釋放；下調(diào)Caspase-3活化片段蛋白的表達，減少高糖誘導下雪旺細胞的凋亡，其中0.60mmol/L的含氫培養(yǎng)液處理效果最為明顯。
　　實驗二、
　　飽和富氫液對糖尿病外周神經(jīng)病變大鼠的保護作用
　　目的：飽和富氫液是一

11、種溶解氫氣至飽和狀態(tài)的生理鹽水，通過體外高糖培養(yǎng)雪旺細胞離體模型的研究發(fā)現(xiàn)，富氫液具有抗氧化、抗炎、減少高糖誘導雪旺細胞凋亡的作用。本實驗以前期體外培養(yǎng)雪旺細胞實驗研究為基礎，利用糖尿病大鼠實驗模型，擬探討飽和富氫液對糖尿外周神經(jīng)病變治療效果。
　　方法：健康雄性SD大鼠，體重280-310g(中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心)。腹腔注射鏈脲霉素(65 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型。
　　第一部分：不同劑量的飽和富氫液對于糖

12、尿周圍神經(jīng)病變大鼠模型的保護作用。40只大鼠隨機分為5組(n=6)，正常對照組(Con組)，糖尿病模型組(DM組)、飽和富氫液處理組(DM+HS5 ml，10ml，20ml/kg組)。建立糖尿病模型成功4周后，DM+HS組大鼠腹腔注射不同劑量飽和富氫液(5 ml，10ml，20ml/kg/day)連續(xù)治療4周，Con組與DM組大鼠腹腔給予生理鹽水注射持續(xù)4周，觀察各組大鼠神經(jīng)疼痛行為學在不同時間點(5thW、6thW、7thW、8thW

13、末)變化。檢測各組大鼠基礎情況下及第4、8周末，坐骨神經(jīng)傳導速度(MNCV)的變化；第8周末，檢測血糖水平及糖基化終末產(chǎn)物含量，坐骨神經(jīng)炎癥因子(HMGB1、TNF-α、IL-1β及IL-10)水平、氧化應激產(chǎn)物的含量(MDA、SOD)。
　　第二部分：飽和富氫液對于糖尿周圍神經(jīng)病變大鼠模型坐骨神經(jīng)細胞凋亡的影響。18只大鼠隨機分為3組(n=6)，正常對照組(Con)組、糖尿病模型組(DM)、飽和富氫液處理組(DM+HS10ml)

14、。HS(10ml/kg/day)組給予飽和富氫液連續(xù)治療4周，Con組、DM組給予同等體積的生理鹽水，8周末，Western blot法檢測坐骨神經(jīng)細胞中活化的Caspase-3、Bax以及Bcl-2蛋白表達水平。
　　結果：
　　第一部分第8周末，與基礎值相比，Con組大鼠體質(zhì)量增加，糖基化終末產(chǎn)物、血糖水平、神經(jīng)痛閾、MNCV坐骨神經(jīng)炎癥因子水平與基礎值比較無明顯變化。與Con組大鼠相比，糖尿病大鼠體質(zhì)量降低、糖基化終末

15、產(chǎn)物、血糖水平明顯升高、痛閾值明顯降低、炎癥因子釋放與氧化應激產(chǎn)物含量增加(P﹤0.05)；與DM組相比，飽和富氫液治療的各組大鼠體質(zhì)量和血糖水平無明顯改善(P＞0.05)，但大鼠坐骨神經(jīng)傳導速度增加、熱痛閾和機械性痛閾提高(P﹤0.05)，坐骨神經(jīng)中氧化應激產(chǎn)物含量以及TNF-α、HMGB1、IL-1β水平降低，IL-10水平升高，且10ml/kg飽和富氫液治療組效果最為明顯(P﹤0.05)。
　　第二部分：與Con組相比，DM

16、組與HG+HS組大鼠坐骨神經(jīng)中活化的Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達增加，與DM組相比較，HG+HS組大鼠坐骨神經(jīng)中活化的Caspase-3、Bax蛋白表達減少，Bcl-2蛋白表達增加(P﹤0.05)。
　　結論：氧化應激、炎癥因子釋放以及細胞凋亡參與了糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展；飽和富氫液可通過抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)炎癥因子釋放，對糖尿病周圍神經(jīng)病變產(chǎn)生保護作用。
　　實驗三、
　　線粒體ATP敏感性鉀

17、通道參與富氫液對糖尿病外周神經(jīng)病變大鼠的保護作用
　　目的：飽和富氫液可通過抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)炎癥因子釋放，有效的減輕糖尿周圍神經(jīng)病變損傷。線粒體ATP敏感性鉀通道(MitoKATP通道)是多種處理措施或藥物的作用靶點，該通道激活后可有效的減輕神經(jīng)細胞的損傷。本實驗擬探討飽和富氫液對糖尿周圍神經(jīng)病變保護機制，是否與線粒體ATP敏感性鉀通道激活相關。
　　方法：腹腔注射鏈脲霉素(65 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型，18只糖

18、尿病大鼠，隨機分為3組：分為糖尿病組(DM組)、富氫水治療組(HS組)、ATP敏感鉀通道阻滯劑組(5-HD組)。HS組、5-HD組大鼠造模成功4周后，給予腹腔注射飽和富氫液(10ml/kg/day)連續(xù)治療4周，DM組給予腹腔注射生理鹽水(10ml/kg/day)。第8周末，檢測各組大鼠坐骨疼痛行為學變化、神經(jīng)傳導速度功能的變化；并檢測坐骨神經(jīng)炎性因子(HMGB1、TNF-α、IL-1β、及IL-10)、氧化應激水平及坐骨神經(jīng)細胞凋亡及

19、凋亡相關蛋白表達情況。
　　結果：
　　(1)第8周末，各組糖尿病大鼠體質(zhì)量降低、血糖水平升高；與DM組、5-HD組相比，飽和富氫液治療組血清糖基化終末產(chǎn)物明顯降低，糖尿病組與5-HD組相比無明顯變化(P﹤0.05)；
　　(2)第8周末，與飽和富氫液治療組相比，糖尿病組、5-HD組大鼠坐骨神經(jīng)傳導速度減慢、熱痛閾和機械性痛閾降低(P﹤0.05)；糖尿病組與5-HD組相比無明顯變化(P＞0.05)。
　　(3)第

20、8周末，與飽和富氫液治療組相比，糖尿病組、5-HD組大鼠坐骨神經(jīng)HMGB1、 TNF-α、IL-1β表達水平升高，IL-10表達水平降低(P﹤0.05)。
　　(4)第8周末，與飽和富氫液治療組相比，糖尿病組、5-HD組大鼠坐骨神經(jīng)凋亡陽性細胞數(shù)目增加，Caspase-3蛋白表達增加(P﹤0.05)。
　　結論：飽和富氫液產(chǎn)生抗氧化、抗凋亡作用、調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，發(fā)揮對糖尿病周圍神經(jīng)病變產(chǎn)生保護作用，可能與ATP敏感性鉀通

21、道的激活相關。
　　小結
　　1．飽和富氫液可有效地減少高糖誘導的雪旺細胞損傷，該保護作用與飽和富氫液調(diào)控炎癥反應和抗氧化應激、抗凋亡相關；
　　2．飽和富氫液減輕大鼠糖尿病神經(jīng)病變的機制，與調(diào)控炎癥反應和氧化應激有關；
　　3．飽和富氫液可通過抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用，部分逆轉(zhuǎn)糖尿病引發(fā)外周神經(jīng)病變，該機制與線粒體ATP敏感性鉀通道的激活相關；治療過程中均未發(fā)現(xiàn)毒副作用，為其臨床應用提供了理論依據(jù)和實驗基礎。