柘樹(shù)果實(shí)抗氧化成分分析及其異黃酮Scandenolone誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡通路研究.pdf

1、目的:
　　運(yùn)用多種分離設(shè)備對(duì)柘果的抗氧化成分進(jìn)行提取、分離、純化，核磁和液質(zhì)聯(lián)用設(shè)備進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得到柘果中的化合物。從細(xì)胞凋亡通路著手，分析異黃酮Scandenolone對(duì)乳腺癌細(xì)胞M231的抑制機(jī)理。通過(guò)一系列的研究，從而得到柘果的指紋圖譜，進(jìn)一步得到柘果的藥用價(jià)值及其相應(yīng)的作用機(jī)制。
　　方法:
　　(1)首先通過(guò)乙醇浸提柘樹(shù)果實(shí)，然后進(jìn)行大孔樹(shù)脂和十八烷基硅烷鍵合硅膠(ODS)分離柱柱分離，最后運(yùn)用制備液相設(shè)

2、備得到柘樹(shù)果實(shí)中的抗氧化成分單體，用液質(zhì)聯(lián)用儀和核磁等手段進(jìn)行單體結(jié)構(gòu)的確定。
　　(2) MTT檢測(cè)異黃酮Scandenolone對(duì)M231細(xì)胞生長(zhǎng)影響;原子力顯微鏡(atomicforce microscopy，AFM)觀察異黃酮Scandenolone對(duì)M231細(xì)胞形態(tài)的影響;流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）觀察異黃酮Scandenolone對(duì)M231細(xì)胞周期的影響;FCM觀察異黃酮Scandenolone

3、對(duì)M231細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membranepotential，MMP)的影響;熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)異黃酮Scandenolone對(duì)M231細(xì)胞活性氧(reactie oxygen species，ROS)水平影響;Western blot測(cè)定異黃酮Scandenolone對(duì)M231細(xì)胞信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響，蛋白包括:casepase-3，PARP，Bcl-2，Bax，Bcl-xL, Bad,(p)-p53,(p

4、)-JNK,(p)-ERK,(p)-AKT,(p)-p38, GADPH。
　　結(jié)果:
　　(1)經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂柱分離后，得到4部分粗提物，分別是30％-乙醇粗提物(2.8g)，50％-乙醇粗提物(4.0g)，75％-乙醇粗提物(3.7g)，95％-乙醇粗提物(0.3g)。將4部分粗提物進(jìn)行抗氧化能力分析，發(fā)現(xiàn)75％-乙醇部分抗氧化能力最強(qiáng)，進(jìn)一步分離純化得到13個(gè)單體，其中4個(gè)已經(jīng)得到其具體結(jié)構(gòu)，分別為:Arctiin，er

5、ythrivarone A，2-(3,4-dimethoxybenzyl)-3-(3-methoxy-4-hydroxybenzyl)-(c)-butyrolactone, lappaol F。
　　(2) Scandenolone可明顯的抑制乳腺癌細(xì)胞M231的生長(zhǎng)，當(dāng)用20ug/mL濃度的Scandenolone作用細(xì)胞72h后，細(xì)胞幾乎完全停止生長(zhǎng)，選定3個(gè)濃度(10，12.5，15ug/ml)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);AFM結(jié)果，Sc

6、andenolone作用細(xì)胞24h后，發(fā)現(xiàn)隨濃度的增大，細(xì)胞形狀逐漸從菱形變?yōu)閳A形，且細(xì)胞體積逐漸縮小，并從壁上脫落。FCM結(jié)果，引起Sub-G1凋亡峰百分?jǐn)?shù)急劇增加，由低濃度組(10ug/ml)的17.9％上升到高濃度組(15ug/ml)的99.3％，同對(duì)照組比所有作用濃度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，而在Scandenolone作用下，G0/G1，S和G2/M峰沒(méi)受多大影響，且隨著藥物濃度的增加，線粒體膜電位下降。熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)

7、果，隨著藥物濃度增加，ROS含量會(huì)升高，當(dāng)處理時(shí)間為30min時(shí)，ROS含量上升到最大，隨后趨于穩(wěn)定。western blot結(jié)果，不同濃度Scandenoloneon作用M231細(xì)胞24 h后，各刺激組casepase-3表達(dá)量降低，并且給藥組同對(duì)照組相比都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，PARP表達(dá)量也明顯降低，給藥組同對(duì)照組比都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);隨著Scandenolone劑量的增加，在總的p53蛋白水平變化不大(

8、P＞0.05)，而p53的磷酸化增加，給藥組同同對(duì)照組比都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);上調(diào)Bax和Bcl-2的表達(dá)，但是Bax/Bcl-2的比值隨著Scandenolone的濃度增加而呈劑量效應(yīng)的下降(P＜0.001)，而對(duì)Bad、Bcl-xl蛋白的表達(dá)無(wú)顯著影響;隨著Scandenoloneon劑量的增加，在總的p38 MAPKs蛋白水平保持不變的情況下(P＞0.05)，而p38 MAPKs的磷酸化水平隨劑量的增加而增加，給藥組

9、同同對(duì)照組比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，除低劑量組（0.5ug/ml）例外。而AKT，ERK，JNK三個(gè)激酶磷酸化水平基本沒(méi)變。
　　結(jié)論:
　　(1)得到4個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，它們是Arctiin，erythrivarone A，2-(3,4-dimethoxybenzyl)-3-(3-methoxy-4-hydroxybenzyl)-(c)-butyrolactone, lappaol F。
　　(2) Scand