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文檔簡介
1、目的:
本課題主要探討中醫(yī)藥益氣養(yǎng)血化瘀法通過調控NK細胞活性來逆轉大鼠肝纖維化,為中醫(yī)藥益氣養(yǎng)血化瘀法逆轉大鼠肝纖維化提供科學循證依據(jù)。
方法:
第一部分:大鼠肝纖維化模型構建。除正常雄性Wistar大鼠作為空白組,余大鼠40%CCL4橄欖油混合液皮下注射(5ml/kg,2次/周,共9周),6周處死6只大鼠取肝組織動態(tài)觀察肝組織HE染色、Masson染色情況,造模9周處死6只大鼠采取鼠外周血用放射免疫法檢
2、測肝纖維化指標(HA、LN),并取肝右葉組織進行肝組織HE染色、Masson染色,并用免疫組化染色S-P法、平均光密度檢測肝組織α-SMA表達水平來結果確定造模成功。
第二部分:NK細胞與益氣養(yǎng)血化瘀法治療肝纖維化的相關性研究。確定大鼠肝纖維化造模成功后進行分組,第10周停止造模并分為4組:扶正化瘀膠囊治療組、干擾素α-2b治療組、模型對照組、空白對照組,各組均12只大鼠并編號后予以藥物干預(扶正化瘀膠囊、干擾素α-2b),剩
3、余兩組大鼠予等體積生理鹽水灌胃,治療8周后停止給藥禁食12小時。取股動脈血檢驗HA、LN;通過免疫組化的S-P法、平均光密度檢測肝組織中α-SMA表達及肝組織中NK細胞數(shù)量;從鼠抗凝血中分離NK細胞,并加入CD107a及CD56的抗體,通過流式細胞儀檢測CD107a/CD56陽性率;并將鼠肝星形細胞(HSC-T6)與分離的Wistar鼠NK細胞孵育并加入PI、CFSE染色劑對細胞進行標記,用熒光顯微鏡定性觀察HSC-T6被殺傷情況及情況
4、及流式細胞標記法檢測NK細胞對HSC-T6的殺傷力。
結果:
第一部分:隨著造模時間增加,大鼠逐漸精神狀態(tài)及食欲稍變差,皮毛變黃,且局部皮毛有脫落;模型組大鼠肝臟邊緣變鈍,表面不光滑,局部稍有小結節(jié)樣改變;肝臟組織病理染色可見匯管區(qū)有大量膠原纖維沉積,膠原纖維向匯管區(qū)以外延伸,部分肝臟有厚薄不等的纖維間隔形成,分割包繞肝小葉。肝纖維化指標(HA、LN)檢驗結果顯示模型組較空白組含量增高(P<0.05);免疫組化S-P
5、法、平均光密度檢測α-SMA表達含量模型組較空白組明顯增高(P<0.05)。
第二部分:扶正化瘀膠囊組及干擾素組的大鼠精神狀態(tài)、皮毛色澤較模型組大鼠有改善。肉眼觀察扶正化瘀膠囊組及干擾素α-2b組大鼠肝臟外觀無明顯差異,局部粗糙呈顆粒狀,無明顯結節(jié)隆起,邊緣變鈍,而模型組整個肝臟呈粗大小不等結節(jié)樣變化,肝臟質地較硬,部分大鼠肝臟呈黃褐色樣變。肝纖維化指標結果顯示扶正化瘀膠囊組、干擾素α-2b組大鼠外周血中的HA、LN含量水平相
6、當,無明顯差異,但以上兩組大鼠外周血中的HA、LN均較模型組降低且具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);通過免疫組化S-P法、平均光密度檢測到扶正化瘀膠囊組及干擾素α-2b組大鼠肝組織中α-SMA含量均較模型組含量降低且有統(tǒng)計學意義(P<0.05);用同樣方法測得扶正化瘀膠囊組大鼠肝組織中的NK細胞數(shù)量與其它組水平相當無明顯差異。通過流式細胞儀檢測外周血中NK細胞活性,結果顯示與干擾素治療組、模型對照組及正常空白組比較,扶正化瘀組的CD107
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