Ets2對食管鱗癌細(xì)胞生長、侵襲及mTOR-p70S6K分子信號的調(diào)控作用.pdf

1、食管癌又被稱之為食道癌，是食管腺以及食管粘膜的惡性上皮性腫瘤，臨床主要有食管腺癌和食管鱗癌兩種類型，而二者的病理轉(zhuǎn)歸及發(fā)病機(jī)制不同。食管癌的死亡率和發(fā)病率在全世界惡性腫瘤排行中分別居于第8位和第9位。食管癌呈地域性分布，西方國家以腺癌為主；在亞洲地區(qū)以鱗狀細(xì)胞癌為主。我國食管鱗癌高發(fā)地在華北太行山脈附近，其中河南省林州市發(fā)病率最高。雖然食管癌方面的臨床和基礎(chǔ)研究已經(jīng)持續(xù)了很多年，但其發(fā)病的原因尚不完全清楚。
　　傳統(tǒng)的治療方法主要

2、有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)療法?；颊咴谑彻馨┌l(fā)病早期臨床癥狀和體征無特異性，也沒有特異性的腫瘤分子標(biāo)志物，癥狀明顯時多數(shù)病人已是腫瘤的中晚期，出現(xiàn)周圍組織浸潤或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，失去了最佳治療時機(jī)，這類患者5年的生存率小于10％。所以，尋找有效的診斷標(biāo)志物和治療干預(yù)的生物靶點(diǎn)及其作用的分子機(jī)制十分重要。
　　Ets2為Ets轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，能夠調(diào)控許多下游靶基因，通過蛋白之間的相互作用或者信號通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、分化、增殖、轉(zhuǎn)移

3、以及血管生成、器官發(fā)生等。Ets2在各種細(xì)胞和組織中均有表達(dá)，但是在不同的細(xì)胞和組織中其表達(dá)量和功能也具有差異性。研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤中均發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Ets2存在表達(dá)異常的現(xiàn)象，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，轉(zhuǎn)錄因子Ets2可能成為腫瘤的一個潛在癌癥診斷的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。然而，目前關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子Ets2對食管鱗癌細(xì)胞的影響報道較少，僅有研究顯示轉(zhuǎn)錄因子Ets2在食管鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)。因此深入研究轉(zhuǎn)錄因子 Ets2在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作

4、用機(jī)制，能夠為研究食管鱗癌的發(fā)生機(jī)制及生物治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　本課題以轉(zhuǎn)錄因子Ets2為研究對象，檢測其在正常食管上皮細(xì)胞和不同食管鱗癌細(xì)胞株中的蛋白水平表達(dá)差異，并采用RNA干擾技術(shù)靶向沉默Ets2基因，研究Ets2表達(dá)下降對食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，初步探討Ets2在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　本課題主要分為兩部分：
　　第一部分：檢測轉(zhuǎn)錄因子Ets2在食管鱗癌細(xì)胞株EC1、Eca109、EC

5、9706中的蛋白表達(dá)情況。
　　第二部分：研究轉(zhuǎn)錄因子Ets2在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用。通過靶向特異性的siRNA阻斷Ets2基因表達(dá)，檢測Ets2表達(dá)下調(diào)對食管鱗癌細(xì)胞株增殖、侵襲、周期和凋亡的影響，并檢測mTOR-p70S6K信號通路主要蛋白的表達(dá)情況，初步研究Ets2基因在食管鱗癌細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.食管鱗癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Ets2的表達(dá)情況
　　利用Western blot

6、技術(shù)從蛋白水平檢測轉(zhuǎn)錄因子Ets2在正常食管上皮細(xì)胞Het-1A和食管鱗癌細(xì)胞株EC1、Eca109、EC9706中的表達(dá)。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子Ets2對食管鱗癌調(diào)控作用的初步探索
　　體外化學(xué)合成3對針對Ets2基因mRNA的特異性siRNA，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞株，通過Real-time PCR和Western blot篩選效率最高的siRNA片段。利用篩選到的siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染非特異性siRNA的

7、細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞及只加入了轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞作為對照，采用EdU熒光標(biāo)記法和 CCK-8法檢測食管鱗癌細(xì)胞增殖率和細(xì)胞存活率的變化；利用AnnexinV-FITC/PI雙染法及 caspase-3的蛋白水平表達(dá)情況分析細(xì)胞凋亡的變化；流式細(xì)胞儀檢測食管鱗癌細(xì)胞周期的變化；Transwell小室法檢測食管鱗癌細(xì)胞侵襲能力的變化，Western blot檢測E-cadherin的表達(dá)情況來反應(yīng)食管鱗癌細(xì)胞粘附能力的變化；通過West

8、ern blot檢測mTOR/p70S6K途徑主要蛋白的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果：
　　1.食管鱗癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Ets2的表達(dá)情況
　　Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子Ets2在正常食管上皮細(xì)胞和食管鱗癌細(xì)胞株中均有表達(dá)，與正常食管上皮細(xì)胞Het-1A相比，Ets2在食管鱗癌細(xì)胞EC1、Eca109和EC9706中的蛋白表達(dá)量均明顯升高，尤其在EC9706細(xì)胞中增加最為顯著，因此采用EC9706細(xì)胞篩選si

9、RNA干擾片段。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子Ets2對食管鱗癌調(diào)控作用的初步探索
　　3對Ets2基因的特異性siRNA干擾片段中，Ets2 siRNA1在轉(zhuǎn)染48h后，轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的沉默效果相對較好，因此選用Ets2 siRNA1片段轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞系EC1、Eca109、EC9706進(jìn)行后續(xù)實驗。與對照組相比，靶向siRNA下調(diào)Ets2基因表達(dá)后，可以明顯地抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖；Ets2 siRNA組的食管鱗癌細(xì)胞的早期凋

10、亡比例上升，凋亡蛋白caspase-3的蛋白水平表達(dá)增多，說明下調(diào)Ets2基因能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Ets2表達(dá)下調(diào)的食管鱗癌細(xì)胞Eca109、EC1的G0/G1期細(xì)胞明顯增加；減弱食管鱗癌細(xì)胞侵襲能力，且E-cadherin的蛋白表達(dá)上升說明食管鱗癌細(xì)胞的粘附能力增強(qiáng)；此外，Western blot檢測顯示Ets2 siRNA組mTOR/p70S6K信號通路中的關(guān)鍵蛋白p-mTOR和p-p70S6K的表達(dá)量明顯下降。
　　結(jié)論：

11、r>　　1.轉(zhuǎn)錄因子Ets2在三株食管鱗癌細(xì)胞中均呈高表達(dá)；
　　2.靶向siRNA下調(diào)Ets2表達(dá)后，食管鱗癌細(xì)胞的增殖能力減弱，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，細(xì)胞的侵襲能力減弱，說明轉(zhuǎn)錄因子Ets2表達(dá)下調(diào)能夠有效抑制食管鱗癌細(xì)胞生長和侵襲；
　　3. Ets2表達(dá)下調(diào)的食管鱗癌細(xì)胞株中，mTOR/p70S6K中關(guān)鍵因子表達(dá)量明顯下調(diào)，初步推測 Ets2可能通過 mTOR/p70S6K信號通路在食管鱗癌發(fā)生