AMPK-α、γ亞基的表達(dá)及與潛在小分子激動劑相互作用的初步研究.pdf

1、依賴于5’-AMP激活的蛋白激酶(AMPK)是一種蘇氨酸/絲氨酸激酶，被稱為“細(xì)胞能量代謝的主要調(diào)節(jié)器”。細(xì)胞能量代謝失衡，會引起代謝綜合征等多種疾病，嚴(yán)重影響人類的健康。作為能量代謝過程中重要的調(diào)節(jié)酶，AMPK可以作為代謝綜合征的治療靶點。
　　 迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了AMPK的一些小分子激動劑，如metformin、AICAR、噻唑類化合物等，其中，metformin和噻唑類化合物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病的治療。然而，現(xiàn)有的藥

2、物存在著特異性差，用量大等缺點。尋找高效、低毒和特異性強(qiáng)的AMPK小分子激動劑，已成為新型代謝綜合征治療藥物的重要研究方向。
　　 本論文首先通過細(xì)胞水平實驗發(fā)現(xiàn)了Gambogic Acid對AMPK的激活作用。結(jié)合蛋白質(zhì)異源表達(dá)和體外相互作用實驗，表明Gambogic Acid與AMPK具有較強(qiáng)的相互作用。進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)截短實驗，確證Gambogic Acid可能與AMPK-α亞基的催化區(qū)域結(jié)合。
　　 本論文構(gòu)建了

3、AMPK-α蛋白、AMPK-α392蛋白、AMPK-α312蛋白、AMPK-α200蛋白以及AMPK-γ蛋白的原核表達(dá)體系，并通過對培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間等表達(dá)條件的摸索，確立了異源表達(dá)可溶性AMPK-α蛋白、截短蛋白以及AMPK-γ蛋白的表達(dá)條件：表達(dá)載體為pET32a(+)，BL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)，選擇LB或TB培養(yǎng)基，0.1mmol/L IPTG、16℃，165 r/min誘導(dǎo)20h，并通過親和柱層析的方法獲得可溶性的A

4、MPK-α蛋白、AMPK-α392蛋白、AMPK-α312蛋白、AMPK-α200蛋白和AMPK-y蛋白。
　　 采用熒光滴定和ForteBio Octet Red系統(tǒng)，對AMPK蛋白、AMPK-y蛋白、AMPK-α蛋白與Gambogic Acid的體外相互作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明GambogicAcid與AMPK-α亞基具有較強(qiáng)的結(jié)合作用。進(jìn)一步通過不同長度的AMPK-α亞基與Gambogic Acid結(jié)合常數(shù)的比較，推斷Gam