SA-hGM-CSF雙功能融合蛋白中試工藝的研究.pdf

1、目的：
　　為了提高重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)-pET24a-SA-hGM-CSF的產(chǎn)量和表達(dá)量。通過單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，在搖瓶中對(duì)培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行了一系列優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵條件。隨后，在搖瓶表達(dá)條件基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)進(jìn)行了10L發(fā)酵罐(BioFlo(R)415)的表達(dá)工藝摸索，最后確定出適合SA-hGM-CSF高密度發(fā)酵的工藝路線。最后，DEAE FF純化及柱上復(fù)性。研究SA-hGM-CAF中試制備工藝，

2、為后續(xù)的擴(kuò)大培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1. SA-hGM-CSF融合蛋白的發(fā)酵工藝
　　1)搖瓶發(fā)酵的研究
　　通過單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，在搖瓶中對(duì)培養(yǎng)基的成分以及誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括:碳源、有機(jī)氮源、無機(jī)鹽、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、pH和溫度。
　　2)10L發(fā)酵罐發(fā)酵的研究
　　在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的正交試驗(yàn)(L9(43))對(duì)10L發(fā)酵罐的發(fā)酵過程中的pH、補(bǔ)料開始時(shí)間、誘導(dǎo)

3、溫度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)進(jìn)行優(yōu)化。
　　2. SA-hGM-CSF融合蛋白的純化與復(fù)性
　　收集工程菌，菌體經(jīng)高壓破碎儀破菌，將獲得的包涵體經(jīng)包涵體洗滌液洗滌后再用包涵體溶解液溶解，隨后，對(duì)融合蛋白進(jìn)行DEAE FF離子交換層析純化條件的摸索，采用DEAE FF柱上復(fù)性法將純化后的目的蛋白進(jìn)行復(fù)性。RP-HPLC檢測SA-hGM-CSF融合蛋白的純度。
　　3. SA-hGM-CSF融合蛋白的生物學(xué)功能的檢測
　　CCK-

4、8法檢測SA-hGM-CSF融合蛋白和hGM-CSF標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)TF-1細(xì)胞增殖的活性，比較兩者活性的大小;應(yīng)用FCM檢測SA-hGM-CSF融合蛋白對(duì)生物素化的MB49細(xì)胞的錨定率。
　　結(jié)果：
　　1. SA-hGM-CSF融合蛋白的發(fā)酵工藝
　　1)搖瓶發(fā)酵
　　通過搖瓶單因素的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，初步摸索出最佳的培養(yǎng)基（即發(fā)酵培養(yǎng)基）:蛋白胨20g/L，酵母粉12g/L，NaCl10g/L，葡萄糖10g/L，K2HPO

5、4·3H2O1.5g/L，KH2PO42.3g/L，(NH4)2SO42.4g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L;搖瓶的表達(dá)參數(shù)是: IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5mM，誘導(dǎo)時(shí)間為5h， pH=7.0，溫度37℃，整個(gè)搖瓶發(fā)酵持續(xù)時(shí)間為9小時(shí)。
　　2)10L發(fā)酵罐發(fā)酵
　　正交試驗(yàn)結(jié)果分析，最后確定出適合SA-hGM-CSF融合蛋白高密度發(fā)酵的工藝路線。即:將優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基在10L發(fā)酵罐(BioFlo(R)415)中原

6、位滅菌后，按5％接種量將二次活化的種子液接種到發(fā)酵罐中。發(fā)酵的設(shè)置參數(shù)為:轉(zhuǎn)速250-650 rpm，溫度37℃，氧容量控制在50±5％，通氣量、通氧氣、攪拌速度與DO連動(dòng)，pH=7.0。當(dāng)發(fā)酵至3h時(shí)，采用連續(xù)補(bǔ)料的方式給與添加補(bǔ)料，待菌密度OD600=3.0時(shí)，一次性加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，使其終濃度為0.5mM，并設(shè)定誘導(dǎo)溫度為32.5℃。檢測發(fā)酵過程中的攪拌轉(zhuǎn)速及通氧量使發(fā)酵液維持在適當(dāng)?shù)娜苎趿糠秶鷥?nèi)，以pH調(diào)節(jié)物穩(wěn)定發(fā)酵液pH，

7、發(fā)酵持續(xù)時(shí)間約10小時(shí)，每升培養(yǎng)液可收獲濕菌體達(dá)30g左右，表達(dá)水平達(dá)50％以上。
　　2. SA-hGM-CSF融合蛋白的純化與復(fù)性
　　經(jīng)包涵體洗滌液洗滌后，目的蛋白的純度已達(dá)到60％左右，經(jīng)過DEAE FF離子交換層析純化和柱上復(fù)性后，SDS-PAGE和RP-HPLC分析，融合蛋白的純度達(dá)到95％、回收率達(dá)70％以上。復(fù)性后，SA-hGM-CSF融合蛋白主要以單體和多聚體形式同時(shí)存在。
　　3. SA-hGM-C

8、SF融合蛋白的生物學(xué)功能檢測
　　SA-hGM-CSF雙功能融合蛋白具有顯著的增殖TF-1細(xì)胞的活性，且呈劑量依賴性，和hGM-CSF標(biāo)準(zhǔn)品相比，兩者無明顯的差別。其EC50分別為1.460和1.455，活性分別是0.685×106和0.687×106; FCM檢測了SA-hGM-CSF雙功能融合蛋白對(duì)已生物素化的MB49膀胱癌癌細(xì)胞的錨定率，其錨定率可高達(dá)99％左右。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)重組大腸桿菌E.coli

9、 BL21(DE3)-pET24a-SA-hGM-CSF的發(fā)酵工藝進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究，確定了最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了SA-hGM-CSF的高效表達(dá)。通過DEAE FF離子交換層析純化、柱上復(fù)性SA-hGM-CSF融合蛋白，體外TF-1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞錨定實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了SA-hGM-CSF融合蛋白同時(shí)具有雙功能活性:促進(jìn)TF-1細(xì)胞增殖和錨定修飾生物素化的MB49細(xì)胞膜的活性，為后續(xù)的SA-hGM-CSF的工藝化生產(chǎn)及臨床研究