肝靶向肽CSPI-plus修飾的重組人內(nèi)皮抑素對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的作用研究.pdf

1、肝細(xì)胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)生是一個(gè)多因素多階段的復(fù)雜過(guò)程，迄今沒(méi)有有效的根治辦法。尋求新的治療方法和治療新靶標(biāo)是目前肝細(xì)胞性肝癌治療的迫切需求。目前國(guó)內(nèi)外研究一直致力于通過(guò)阻斷腫瘤新生血管形成來(lái)達(dá)到治療腫瘤的目的。血管生成抑制劑，特別是多肽或內(nèi)源性肽可能成為異常血管生成依賴性疾病最安全最低毒的治療措施。內(nèi)皮抑制素（endostatin）是膠原蛋白XVIII羧基末端水解而來(lái)的20 kDa多

2、肽片段，是一種內(nèi)源性血管形成抑制因子，特異性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生和遷移，對(duì)血管形成及腫瘤生長(zhǎng)具有明顯抑制作用。此外研究證實(shí)內(nèi)皮抑素對(duì)乳腺癌、大腸癌等腫瘤細(xì)胞也具有直接的抑制作用。但正如許多血管生成抑制劑一樣，內(nèi)皮抑素單一給藥并不能獲得顯著地療效，加之蛋白制劑存在的問(wèn)題從而使美國(guó)于2003年終止對(duì)內(nèi)皮抑素的臨床開(kāi)發(fā)。近年來(lái)靶向制劑的研究?jī)叭灰呀?jīng)成為國(guó)內(nèi)外藥劑研究的熱點(diǎn)之一。CSP I-plus是從瘧原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白（ Circumsproz

3、oite protein, CSP）中篩選得到的能夠特異識(shí)別并黏附在肝細(xì)胞表面的多肽序列。利用CSP I-plus的這一特性，本實(shí)驗(yàn)室采用基因工程技術(shù)和原核表達(dá)系統(tǒng)成功制備新型肝靶向人內(nèi)皮抑素rES-CSP。目前，該融合蛋白對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用以及肝靶向性已經(jīng)得到證實(shí)，但對(duì)肝癌細(xì)胞的作用尚無(wú)研究報(bào)道，有待進(jìn)一步探討。
　　本論文意在進(jìn)一步從體內(nèi)原位肝癌模型驗(yàn)證rES-CSP肝靶向性的基礎(chǔ)上，采用HepG2細(xì)胞和裸鼠原位肝癌模型從細(xì)

4、胞和動(dòng)物整體水平評(píng)價(jià)其抗肝癌效果并初步探討凋亡相關(guān)的分子機(jī)制。
　　研究目的：
　　本論文通過(guò)研究新型肝靶向人內(nèi)皮抑素rES-CSP對(duì)肝癌細(xì)胞的直接抑制作用，為rES-CSP抑制肝癌生長(zhǎng)的作用靶點(diǎn)進(jìn)行了補(bǔ)充，從而為肝癌靶向治療提供新的科學(xué)依據(jù)和藥物開(kāi)發(fā)思路。
　　研究方法：
　　1.探討rES-CSP的肝靶向性
　　1.1. rES-CSP的裸鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)：建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型，通過(guò)瘤塊種植法法建立

5、肝原位移植瘤模型。將裸鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照（生理鹽水）組，重組人血管內(nèi)皮抑素（rEndostatin）組，融合蛋白（rES-CSP）組。建模1月后單次尾靜脈給藥，分別于5、30和60 min取血后處死動(dòng)物，取心、肝、脾、肺、腎、腫瘤組織制備勻漿，ELISA方法測(cè)定各樣品中內(nèi)皮抑素濃度。
　　2.探討rES-CSP的體外抗HCC作用及凋亡相關(guān)分子機(jī)制
　　2.1. MTS方法分別檢測(cè)給予終濃度為12μM、6μM、1.2μM、0.

6、6μM、0.06μM的重組人血管內(nèi)皮抑制素、CSPI-plus和肝靶向人內(nèi)皮抑素rES-CSP作用24 h和48 h后對(duì)HepG2、Chang’s和A549細(xì)胞的毒性作用，以選擇合適的藥物濃度進(jìn)行后續(xù)的活性研究。其后，分別從遷移分析、流式細(xì)胞術(shù)和透射電鏡來(lái)考察rES-CSP抗肝癌細(xì)胞遷移及對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。
　　2.2.Western Blot檢測(cè)rES-CSP誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制，分別給予終濃度為0.6μM、6μ

7、M的重組人內(nèi)皮抑制素和肝靶向人內(nèi)皮抑素rES-CSP作用24 h后收集細(xì)胞并裂解，提取蛋白后分別與凋亡蛋白Caspase8抗體、凋亡抑制蛋白Bcl-2抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)并分析細(xì)胞內(nèi)Caspase8和Bcl-2的表達(dá)變化。
　　3.探討rES-CSP的體內(nèi)抗HCC作用
　　3.1.建立肝原位移植瘤模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組10只：①空白組(生理鹽水)，②rEndostatin(6μM)組，③rES-CSP(6μM

8、)組。建模1周后隔天靜脈給藥，連續(xù)用藥30天。處死動(dòng)物，觀察肝臟腫瘤生長(zhǎng)情況，剝離肝組織中的瘤塊稱(chēng)瘤重，計(jì)算抑瘤率；
　　3.2.取肝癌組織做石蠟切片，HE染色觀察組織的病理學(xué)改變。免疫組化比較肝癌組織中CD31的表達(dá)變化。
　　4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差（x?s）表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊時(shí)多重比較采用LSD法；方差不齊時(shí)，

9、多重比較采用Dunnett T3法。P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.探討rES-CSP的肝靶向性:
　　1.1.肝原位種植瘤模型制備：取人肝癌細(xì)胞系HepG2制備皮下移植瘤，后將腫瘤組織接種于裸鼠肝內(nèi)，建立裸鼠肝原位移植瘤模型。
　　1.2.rES-CSP的裸鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)：荷肝癌原位裸鼠尾靜脈給藥，ELISA方法測(cè)定給藥后5、30和60 min時(shí)裸鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腫瘤

10、組織和血液中內(nèi)皮抑素濃度，結(jié)果顯示肝靶向內(nèi)皮抑素與普通重組人內(nèi)皮抑素組相比，各臟器內(nèi)皮抑素濃度均有顯著性差異（P﹤0.05）；各時(shí)間點(diǎn)肝靶向人內(nèi)皮抑素rES-CSP組肝臟及肝癌組織內(nèi)皮抑素濃度均高于普通內(nèi)皮抑素組（P﹤0.01）。
　　2.探討rES-CSP的體外抗HCC作用及凋亡相關(guān)分子機(jī)制
　　2.1.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：MTS結(jié)果顯示rES-CSP對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖有抑制作用，且呈時(shí)間和劑量的依賴性。而CSP I-plu

11、s、rEndostatin均對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖幾乎無(wú)影響。同時(shí)在低濃度時(shí)，rES-CSP對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用明顯高于Chang’s和A549細(xì)胞（P﹤0.01）。在6μM時(shí)，HepG2細(xì)胞的存活率為46.3±2.31％，Chang’s和A549細(xì)胞的存活率分別為92.8±2.11%、93.2±2.96%。
　　2.2.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：隨著時(shí)間的推移，rES-CSP組能顯著抑制肝癌細(xì)胞劃痕的愈合，與重組人內(nèi)皮抑素組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

12、義（P﹤0.05）。同時(shí) Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)6μM rEndostatin或rES-CSP處理后的肝癌細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量明顯減少(P值均﹤0.05)，遷移抑制率分別為27±1.75%、65.5±2.95%。
　　2.3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡：結(jié)果顯示，6μMrEndostatin作用24 h和48 h后，肝癌細(xì)胞的周期分布和凋亡幾乎不受影響（P＞0.05）。而rES-CSP顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)

13、胞G2/M期細(xì)胞數(shù)目增加同時(shí)伴隨著G0/G1和S期細(xì)胞減少(P﹤0.01)，同時(shí)肝癌細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率顯著高于對(duì)照組細(xì)胞（P﹤0.01）。
　　2.4.透射電鏡觀察細(xì)胞的凋亡：結(jié)果顯示rES-CSP處理后，肝癌細(xì)胞多出現(xiàn)中晚期凋亡，可見(jiàn)細(xì)胞膜出芽，凋亡小體形成，內(nèi)含有退變的細(xì)胞器。核碎裂，核固縮，胞核染色質(zhì)邊集、成碎塊狀，核膜消失。
　　2.5.Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化：rES-

14、CSP可顯著降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平，同時(shí)可能上調(diào)Caspase8蛋白的表達(dá)。rEndostatin處理組對(duì)Bcl-2和Caspase8兩種蛋白的表達(dá)影響不明顯。
　　3.探討rES-CSP的體內(nèi)抗HCC作用及相關(guān)分子表達(dá)變化
　　3.1.體內(nèi)對(duì)裸鼠肝癌原位移植瘤的抑制作用：rES-CSP組與重組人血管內(nèi)皮抑素組、對(duì)照組相比，瘤重和瘤體積均有顯著性差異（P＜0.05），結(jié)果表明rES-CSP能顯著抑制人肝癌裸鼠原位移植瘤的

15、生長(zhǎng)，重組人內(nèi)皮抑素對(duì)肝癌的生長(zhǎng)抑制作用不明顯；rES-CSP和rEndostatin組的人肝癌裸鼠荷瘤的抑瘤率為29.6±4.39%和5.30±1.23%。
　　3.2.HE染色觀察組織的病理變化：肝癌細(xì)胞呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，rES-CSP組同實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，rES-CSP組癌組織多發(fā)生壞死，間質(zhì)血管少于對(duì)照組，癌細(xì)胞核分裂相對(duì)減少，可見(jiàn)有大量白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，表明 rES-CSP組對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用。然而部分肺病理切片

16、觀察可見(jiàn)肺泡間隔增厚，肺泡壁和細(xì)支氣管壁有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，顯示出較重的間質(zhì)性肺炎病變。
　　3.3.免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝癌組織中微血管密度和凋亡抑制蛋白 Bcl-2的表達(dá)變化：與對(duì)照組相比，rEndostatin組和rES-CSP組腫瘤組織微血管密度相對(duì)減小，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　肝靶向肽CSP I-plus修飾的重組人內(nèi)皮抑素能靶向結(jié)合于肝細(xì)胞表面分子HSPG，從而在肝臟組織得到

17、明顯富集。體外抗HCC活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)rES-CSP可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，阻滯細(xì)胞的復(fù)制周期，并且增加肝癌細(xì)胞的凋亡率。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，rES-CSP能夠顯著抑制裸鼠原位肝癌的生長(zhǎng)，作用效果顯著強(qiáng)于重組人血管內(nèi)皮抑制素，并且肝癌組織CD31蛋白表達(dá)下調(diào)與重組人血管內(nèi)皮抑制素組相比具有顯著差異。綜上所述，肝靶向肽CSP I-plus修飾的重組人內(nèi)皮抑素能在肝臟組織富集，從而提高內(nèi)皮抑素對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向抑制作用，為肝癌的靶向治療提供新的