尿激酶與阿替普酶在大鼠腦出血后血腫纖溶治療中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)病死率致殘率高，是最具破壞的卒中類型。據(jù)一項(xiàng)2017年發(fā)表的全國性調(diào)查統(tǒng)計(jì)顯示，我國每年卒中的年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為246.8/10萬人，其中ICH占了23.8％，遠(yuǎn)高于大多數(shù)西方國家。然而，ICH的致傷機(jī)制尚未完全明確，ICH后血腫的物理壓迫及繼發(fā)的血腫旁水腫(perihematomal edema，PHE)形成，均可影響患者預(yù)后。因此，及時(shí)清除血腫，以減輕原發(fā)和繼發(fā)損傷，

2、在ICH治療中顯得尤為重要。
　　然而，受血腫部位及手術(shù)本身創(chuàng)傷所限，開顱血腫清除術(shù)并不總適用。與傳統(tǒng)手術(shù)相比，微創(chuàng)手術(shù)聯(lián)合血腫腔內(nèi)纖溶藥物注射治療對(duì)正常腦組織創(chuàng)傷小，療效好，適用更廣，近年來得到關(guān)注并逐步發(fā)展起來，成為ICH較有前景的治療措施。
　　目前，該措施中最廣泛使用的纖溶藥物是阿替普酶，即組織型纖溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator，tPA)。tPA可有效溶解血腫，在IC

3、H后血腫纖溶治療中療效受到多項(xiàng)臨床試驗(yàn)的認(rèn)可。然而，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，tPA在輔助清除血腫的同時(shí)，存在促進(jìn)水腫形成、增加炎癥反應(yīng)、促進(jìn)神經(jīng)毒性等副作用。這些報(bào)道使tPA在顱內(nèi)纖溶治療的應(yīng)用受到了質(zhì)疑。尿激酶，全稱尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)，作為一個(gè)纖溶老藥（1999年后因停產(chǎn)退出美國市場(chǎng)），在我國廣泛應(yīng)用于ICH后血腫纖溶治療。在部分幕上腦出血，微創(chuàng)手術(shù)聯(lián)合血

4、腫腔內(nèi)uPA注射治療已達(dá)成專家共識(shí)，為A級(jí)推薦。然而，由于對(duì)于uPA和tPA這兩種纖溶藥物在ICH后血腫纖溶治療應(yīng)用上缺少臨床前或臨床研究，藥物的選擇仍憑借經(jīng)驗(yàn)。
　　為了探索uPA與tPA在大鼠腦出血后血腫纖溶治療中的作用及機(jī)制，本研究采用大鼠自體血注射誘導(dǎo)腦出血模型，從兩部分進(jìn)行研究:第一部分觀察uPA和tPA在大鼠ICH后血腫纖溶治療的作用，包括纖溶療效及對(duì)PHE的影響;第二部分則通過檢測(cè)血腦屏障(blood-brain b

5、arrier，BBB)相關(guān)指標(biāo)，對(duì)藥物于BBB的效應(yīng)及機(jī)制進(jìn)行研究。
　　一、尿激酶與阿替普酶在大鼠腦出血后血腫纖溶治療中的作用
　　目的:
　　以大鼠ICH模型為基礎(chǔ)，分別給予uPA和tPA血腫腔內(nèi)注射處理，3天后檢測(cè)血腫體積、PHE范圍、腦水含量(brain water content，BWC)、BBB通透性及動(dòng)物行為學(xué)，觀察uPA和tPA在ICH后血腫纖溶治療的療效。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為

6、5組，即sham組、ICH組、ICH+saline組、ICH+tPA組和ICH+uPA組，每組14只。術(shù)后30分鐘，ICH+saline組、ICH+tPA組和ICH+uPA組分別于血腫中心給予2μl體積的saline、tPA(10μg/μl)、uPA(100IU/μl)，sham組為空白對(duì)照組，只進(jìn)針不注血，ICH組只注血不給藥。術(shù)后第三天，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)和前肢放置實(shí)驗(yàn)以做行為學(xué)評(píng)分，后行磁共振掃描以測(cè)算血腫體積及PHE范圍。掃描

7、完成后，每組中8只測(cè)量BWC以評(píng)估水腫程度，剩余6只行伊文斯藍(lán)(evans blue，EB)滲出實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)BBB通透性。
　　結(jié)果:
　　1.磁共振圖像分析發(fā)現(xiàn)，uPA與tPA血腫腔內(nèi)注射均可有效縮小血腫體積和PHE范圍，且uPA減少PHE范圍的作用更加顯著(uPA vs tPA，p＜0.05)。此外，BWC的測(cè)量結(jié)果顯示，uPA可減輕患側(cè)半球水含量，而tPA組與對(duì)照組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)和前肢放置試驗(yàn)結(jié)

8、果顯示uPA可顯著改善大鼠ICH后神經(jīng)功能，而tPA對(duì)于神經(jīng)功能改善未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　3.uPA與tPA均有效減小了EB染料血管外滲出，提示兩種纖溶藥物在穩(wěn)定ICH后BBB通透性上具有積極作用。
　　結(jié)論:
　　大鼠ICH后血腫腔內(nèi)uPA或tPA注射均可縮小血腫體積及PHE范圍，對(duì)于減少出血后BBB損傷具有一定積極作用。
　　二、尿激酶與阿替普酶對(duì)腦出血后血腦屏障的效應(yīng)及機(jī)制研究
　　目

9、的:
　　建立大鼠ICH模型，觀察給藥后，BBB相關(guān)緊密連接蛋白(claudin-5、ZO-1)及細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表達(dá)情況，探討uPA與tPA對(duì)BBB的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分3組，即ICH+saline組、ICH+tPA組和ICH+uPA組，每組18只。分別于術(shù)后30分鐘于血腫中心給予2μl體積的saline、tPA(10μg

10、/μl)、uPA(100IU/μl)。術(shù)后第三天，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（5/組）通過免疫熒光染色檢測(cè)BBB相關(guān)緊密蛋白(ZO-1，Claudin-5)的表達(dá)，另外，ZO-1還采用蛋白質(zhì)印跡(western blot，WB)法(4/組)進(jìn)行定量比較;采用WB及實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)MMPs(4/組)的表達(dá);采用WB（5/組）檢測(cè)平p65與磷酸化p65(p-p65)水

11、平，通過p-p65/p-65間接反映NF-κB通路活性。
　　結(jié)果:
　　1.通過對(duì)血腫周圍ZO-1表達(dá)檢測(cè)(免疫熒光，WB)和血腫周圍及水腫區(qū)皮質(zhì)的claudin-5免疫染色，發(fā)現(xiàn)uPA與tPA均可上調(diào)這兩種BBB相關(guān)緊密連接蛋白表達(dá)，提示兩種藥物對(duì)維持BBB完整性有積極作用。
　　2.RT-PCR及WB結(jié)果顯示，給藥組有效降低了大鼠ICH后MMP-12表達(dá)，此外，uPA還降低了MMP-2的表達(dá)，而tPA對(duì)于MMP-