rAAV9--CAG-Hamp在鐵過(guò)載小鼠模型中治療的安全性和有效性評(píng)估.pdf

1、目的:鐵調(diào)素表達(dá)下調(diào)是引起非輸血依賴型地貧鐵過(guò)載的主要原因，目前認(rèn)為可通過(guò)增加鐵調(diào)素的表達(dá)用于治療鐵過(guò)載疾病。通過(guò)構(gòu)建重組鐵調(diào)素-腺相關(guān)病毒載體，并轉(zhuǎn)染到鐵過(guò)載小鼠模型體內(nèi)，觀察其在鐵過(guò)載小鼠中對(duì)鐵代謝的影響，并探討其治療效果和相關(guān)作用機(jī)制，為非輸血依賴型地貧患者繼發(fā)性鐵過(guò)載的基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.構(gòu)建鐵過(guò)載小鼠模型，16周后通過(guò)病理HE染色觀察肝臟鐵過(guò)載情況。
　　2.包含目的基因小鼠hamp cD

2、NA的腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建、包裝、純化后獲得滴度滴度1×1012vg/ml。
　　3.鐵過(guò)載小鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E組5組，A、B、C組分別注射濃度為的:2.5×108vg/ml、2.5×109vg/ml、2.5×1010vg/ml的rAAV9-hamp、D組為2.5×1010vg/ml的含AAV-CAG、E組為PBS，注射體積分別為100μl。分別在第2天、14天、28天、56天分別處理5只小鼠，獲取相應(yīng)的組織標(biāo)本。采用熒

3、光檢測(cè)腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染效率、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定外周全血CD8+細(xì)胞比例、Real-Time PCR檢測(cè)肝臟hampmRNA表達(dá)情況、western blot檢測(cè)fpn蛋白表達(dá)情況以及亞鐵嗪法、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法測(cè)定血清鐵及血清鐵蛋白(SF)濃度。
　　結(jié)果:
　　1.鐵過(guò)載小鼠模型肝臟、心臟HE染色見(jiàn)大量有明顯的鐵沉積。
　　2.熒光顯微鏡下見(jiàn)注射含CAG基因的AAV的小鼠肝臟中熒光蛋白表達(dá)強(qiáng)度要明顯高于PBS組;

4、在第56天時(shí)，其表達(dá)強(qiáng)度無(wú)明顯減弱。
　　3.各組注射AAV的小鼠外周血CD8+細(xì)胞比例與PBS組相比未見(jiàn)有明顯升高。4.低濃度實(shí)驗(yàn)組的hamp mRNA表達(dá)量在第2天、14天和56天時(shí)與E組比明顯升高，但其升高水平較中濃度組（A組）低;中濃度實(shí)驗(yàn)組（B組）的表達(dá)量在各時(shí)間段中的表達(dá)均明顯升高;高濃度組（C組）僅在第2天、14天、28天表達(dá)升高，而D組的hamp mRNA表達(dá)變化與E組均無(wú)差異。膜轉(zhuǎn)運(yùn)鐵蛋白(fpn1)的蛋白濃度在

5、第2天時(shí)無(wú)明顯降低;14天之后，三組實(shí)驗(yàn)組的蛋白濃度開始降低;第56天時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組蛋白仍有降低趨勢(shì)。各小組各時(shí)間段血清鐵變化中以B組在第56天與E組相比下降幅度最大，下降水平達(dá)E組的48.6％，而血清鐵蛋白濃度均無(wú)明顯改變。
　　結(jié)論:研究結(jié)果表明rAAV9-hamp可以在小鼠肝臟中成功轉(zhuǎn)染，并使hamp基因在肝臟細(xì)胞中長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá);以中濃度hamp mRNA表達(dá)水平較為穩(wěn)定，且表達(dá)水平明顯高于PBS對(duì)照組; hamp高表達(dá)可降低