2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本項(xiàng)目擬研究miRNA-17在丙泊酚調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用中的分子機(jī)制;同時(shí)構(gòu)建肝臟缺血再灌注大鼠模型,探討丙泊酚和七氟烷是否對(duì)肝臟缺血再灌注具有保護(hù)作用及其具體的作用機(jī)制。
  第一部分 丙泊酚通過調(diào)控miR-17激活STAT3信號(hào)通路抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷
  目的:
  研究miRNA-17在丙泊酚誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用中的分子機(jī)制。
  方法:
  1.體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HU

2、VECs),構(gòu)建缺氧復(fù)氧的細(xì)胞模型;根據(jù)處理因素的不同,分為H/R組,H/R+propofol150μmol/L組,H/R+miR-17inhibitor組,H/R+miR-17 scramble組(NC);
  2.利用Real-time PCR技術(shù)檢測丙泊酚對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-17表達(dá)水平的影響;
  3.利用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測丙泊酚對(duì)HUVECs保護(hù)作用;
  4.利用Annexin-Ⅴ/PI雙染法及流式細(xì)胞

3、術(shù)證實(shí)miR-17抑制劑對(duì)凋亡的抑制作用;
  5.利用Western blot檢測丙泊酚處理和miR-17表達(dá)后Bax和Bcl-2的變化;
  6.利用Western blot檢測miR-17對(duì)STAT3表達(dá)的影響,利用Western blot分析miR-17模擬物轉(zhuǎn)染后STAT3蛋白的變化;
  7.通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)鑒定miR-17與STAT3 mRNA的結(jié)合。
  結(jié)果:
  1.Real-ti

4、me PCR分析發(fā)現(xiàn),HUVECs和H/R HUVECs中的miR-17表達(dá)無明顯改變。但是,經(jīng)丙泊酚處理后,正常細(xì)胞和H/R細(xì)胞中的miR-17表達(dá)均顯著下降。這些結(jié)果表明,miR-17對(duì)H/R導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能具有保護(hù)作用;
  2.CCK-8試驗(yàn)表明,H/R處理之后,丙泊酚處理使細(xì)胞活力顯著上調(diào),轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑使H/R處理之后的細(xì)胞活力上調(diào)。這些結(jié)果表明,給予丙泊酚對(duì)HUVECs有H/R保護(hù)作用,而且該保護(hù)作

5、用可能依賴于miR-17的表達(dá)調(diào)控;
  3.Annexin-Ⅴ/PI雙染法及流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)miR-17抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用,使用miR-17抑制劑或陰性對(duì)照(scramble對(duì)照)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了HUVECs,并用AnnexinⅤ-FITC和碘化丙啶染色,然后在H/R處理之后采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。與未經(jīng)H/R處理組相比,給予丙泊酚后的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少。與轉(zhuǎn)染scramble對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑的細(xì)胞中

6、凋亡細(xì)胞的數(shù)量也發(fā)生類似的減少;
  4.Western blot測定了凋亡相關(guān)蛋白,H/R處理之后給予丙泊酚處理時(shí),凋亡蛋白Bax發(fā)生顯著下調(diào),而抗凋亡蛋白Bcl-2發(fā)生上調(diào)。此外,缺氧處理后進(jìn)行miR-17抑制劑轉(zhuǎn)染時(shí),這些蛋白質(zhì)具有相同的表達(dá)趨勢;
  5.STAT3活化可引起細(xì)胞周期控制調(diào)節(jié)異常以及凋亡基因異常表達(dá),從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此,miR-17可能通過靶向作用于STAT3而抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。為了明確miR-1

7、7是否可以直接靶向作用于HUVECs中的STAT3,進(jìn)行了Western blot分析,發(fā)現(xiàn)miR-17模擬物轉(zhuǎn)染后STAT3蛋白的表達(dá)顯著下調(diào);
  6.將STAT3的3'-UTR克隆到pMIR-REPOR熒光素酶對(duì)照載體。然后制備突變的報(bào)告基因,使其STAT33'-UTR中的miR-17種子匹配序列發(fā)生突變。該STAT33'-UTR和miR-17共轉(zhuǎn)染使相對(duì)熒光素酶活性顯著下降。相反,與NC相比,突變STAT33'-UTR不受

8、miR-17過表達(dá)的影響。這些數(shù)據(jù)表明,STAT3 mRNA和miR-17之間存在直接的相互作用。
  結(jié)論:
  丙泊酚能夠改善缺氧復(fù)氧后臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管內(nèi)皮損傷,這個(gè)保護(hù)作用的機(jī)制之一可能是miR-17下調(diào)介導(dǎo)的STAT3信號(hào)通路激活。
  第二部分 丙泊酚和七氟烷兩種麻醉藥對(duì)肝臟缺血/再灌注損傷的作用
  目的:
  探討并比較丙泊酚和七氟烷對(duì)肝臟缺血/再灌注的作用及其確切的分子機(jī)制。
  

9、方法:
  1.選用雄性SD大鼠,建立肝臟缺血再灌注的模型;
  2.采集肝臟組織,10%福爾馬林固定24小時(shí)以上,包埋后制作4μm厚度切片,然后進(jìn)行HE染色,在光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查,評(píng)估炎癥和組織損傷情況;
  3.使用生化分析儀檢測大鼠血清中的血清ALT、AST和LDH的水平,驗(yàn)證丙泊酚和七氟烷對(duì)這三種酶的作用;
  4.利用聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測大鼠血清中炎性介質(zhì)(TNF-α,、IL-1、IL-10和IL-

10、6)的濃度和水平,以明確丙泊酚和七氟烷是否可以降低這些細(xì)胞因子的水平;
  5.利用qRT-PCR技術(shù)檢測TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10等炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá),進(jìn)一步明確丙泊酚和七氟烷對(duì)這些細(xì)胞因子的水平的作用;
  6.利用Western blot檢測了NF-κB的水平,觀察炎性細(xì)胞因子釋放是否受NF-κB調(diào)控;
  7.利用特定檢測試劑盒評(píng)估大鼠肝組織中氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物MDA和NO以及抗氧化標(biāo)志

11、物SOD的水平;
  8.利用TUNEL法檢測肝組織細(xì)胞凋亡情況;
  9.利用Western blot檢測丙泊酚和七氟烷對(duì)Bcl-2家族、AKT和p38-MAPK信號(hào)通路的影響,探究丙泊酚和七氟烷的抗凋亡機(jī)制;
  10.利用行免疫組化染色檢測丙泊酚和七氟烷對(duì)肝臟I/R損傷大鼠的p-Akt和p-p38表達(dá)的影響。
  結(jié)果:
  1.肝組織損傷的組織學(xué)評(píng)估使用HE染色進(jìn)行。Suzuki評(píng)分顯示IR組的病理

12、改變?yōu)镮R誘導(dǎo)的重度損傷;類似地,丙泊酚和七氟烷降低了Suzuki評(píng)分,即減輕了損傷程度;
  2.血清中釋放的幾種標(biāo)志物評(píng)估肝臟損傷,包括AST、ALT和LDH,I/R組中這些酶的水平明顯升高,但是丙泊酚和七氟烷均使這三種酶的漏出減少;
  3.TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10等炎性因子在肝臟I/R損傷的病理生理中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了明確丙泊酚和七氟烷是否可以降低這些細(xì)胞因子的水平,使用ELISA和qRT-PCR分

13、別測定了它們?cè)诟谓M織中的水平和mRNA表達(dá)。丙泊酚和七氟烷均使TNF-α、IL-1和IL-6的釋放以及mRNA表達(dá)降低,并增加了IL-10的水平。但是,丙泊酚組的IL-1釋放顯著低于七氟烷組,而TNF-α釋放顯著高于七氟烷組;
  4.Western blot檢測了NF-κB的表達(dá),觀察炎性細(xì)胞因子的釋放是否受NF-κB調(diào)控。I/R誘導(dǎo)的P65磷酸化水平升高受到丙泊酚和七氟烷處理的抑制。相反,丙泊酚和七氟烷上調(diào)了IκBα的表達(dá)。丙

14、泊酚對(duì)NF-κB表達(dá)呈現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用;
  5.測定了MDA、SOD和NO的水平,以評(píng)估丙泊酚和七氟烷對(duì)氧化應(yīng)激的影響。MDA和NO的水平于缺血再灌注時(shí)顯著增加,而丙泊酚和七氟烷處理可使其恢復(fù)。與I/R組相比,丙泊酚和七氟烷處理組的SOD水平下降;
  6.TUNEL法檢測顯示I/R組的凋亡率顯著增加,而丙泊酚和七氟烷均使凋亡減輕;
  7.Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí):丙泊酚和七氟烷可抑制缺血性肝損傷中Bcl

15、-2和Bcl-xl等抗凋亡蛋白的下調(diào),而降低Bak和Bax等促凋亡蛋白的上調(diào),最終使誘導(dǎo)肝組織凋亡的細(xì)胞色素C和caspase蛋白表達(dá)下調(diào);
  8.Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí):丙泊酚增強(qiáng)了AKT的磷酸化而抑制了BAD的磷酸化。七氟烷顯著降低了肝臟缺血再灌注誘導(dǎo)的p38磷酸化,而AKT和BAD的總表達(dá)或磷酸化未發(fā)現(xiàn)改變;
  9.免疫組化顯示丙泊酚增加了AKT磷酸化,而七氟烷抑制了p38的磷酸化。
  結(jié)論及意義

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