丙泊酚與七氟烷對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、本項(xiàng)目擬研究miRNA-17在丙泊酚調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用中的分子機(jī)制;同時(shí)構(gòu)建肝臟缺血再灌注大鼠模型，探討丙泊酚和七氟烷是否對(duì)肝臟缺血再灌注具有保護(hù)作用及其具體的作用機(jī)制。
　　第一部分 丙泊酚通過調(diào)控miR-17激活STAT3信號(hào)通路抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷
　　目的：
　　研究miRNA-17在丙泊酚誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用中的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HU

2、VECs)，構(gòu)建缺氧復(fù)氧的細(xì)胞模型;根據(jù)處理因素的不同，分為H/R組，H/R+propofol150μmol/L組，H/R+miR-17inhibitor組，H/R+miR-17 scramble組(NC);
　　2.利用Real-time PCR技術(shù)檢測丙泊酚對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-17表達(dá)水平的影響;
　　3.利用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測丙泊酚對(duì)HUVECs保護(hù)作用;
　　4.利用Annexin-Ⅴ/PI雙染法及流式細(xì)胞

3、術(shù)證實(shí)miR-17抑制劑對(duì)凋亡的抑制作用;
　　5.利用Western blot檢測丙泊酚處理和miR-17表達(dá)后Bax和Bcl-2的變化;
　　6.利用Western blot檢測miR-17對(duì)STAT3表達(dá)的影響，利用Western blot分析miR-17模擬物轉(zhuǎn)染后STAT3蛋白的變化;
　　7.通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)鑒定miR-17與STAT3 mRNA的結(jié)合。
　　結(jié)果：
　　1.Real-ti

4、me PCR分析發(fā)現(xiàn)，HUVECs和H/R HUVECs中的miR-17表達(dá)無明顯改變。但是，經(jīng)丙泊酚處理后，正常細(xì)胞和H/R細(xì)胞中的miR-17表達(dá)均顯著下降。這些結(jié)果表明，miR-17對(duì)H/R導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能具有保護(hù)作用;
　　2.CCK-8試驗(yàn)表明，H/R處理之后，丙泊酚處理使細(xì)胞活力顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑使H/R處理之后的細(xì)胞活力上調(diào)。這些結(jié)果表明，給予丙泊酚對(duì)HUVECs有H/R保護(hù)作用，而且該保護(hù)作

5、用可能依賴于miR-17的表達(dá)調(diào)控;
　　3.Annexin-Ⅴ/PI雙染法及流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)miR-17抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，使用miR-17抑制劑或陰性對(duì)照（scramble對(duì)照）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了HUVECs，并用AnnexinⅤ-FITC和碘化丙啶染色，然后在H/R處理之后采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。與未經(jīng)H/R處理組相比，給予丙泊酚后的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少。與轉(zhuǎn)染scramble對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑的細(xì)胞中

6、凋亡細(xì)胞的數(shù)量也發(fā)生類似的減少;
　　4.Western blot測定了凋亡相關(guān)蛋白，H/R處理之后給予丙泊酚處理時(shí)，凋亡蛋白Bax發(fā)生顯著下調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2發(fā)生上調(diào)。此外，缺氧處理后進(jìn)行miR-17抑制劑轉(zhuǎn)染時(shí)，這些蛋白質(zhì)具有相同的表達(dá)趨勢;
　　5.STAT3活化可引起細(xì)胞周期控制調(diào)節(jié)異常以及凋亡基因異常表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，miR-17可能通過靶向作用于STAT3而抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。為了明確miR-1

7、7是否可以直接靶向作用于HUVECs中的STAT3，進(jìn)行了Western blot分析，發(fā)現(xiàn)miR-17模擬物轉(zhuǎn)染后STAT3蛋白的表達(dá)顯著下調(diào);
　　6.將STAT3的3'-UTR克隆到pMIR-REPOR熒光素酶對(duì)照載體。然后制備突變的報(bào)告基因，使其STAT33'-UTR中的miR-17種子匹配序列發(fā)生突變。該STAT33'-UTR和miR-17共轉(zhuǎn)染使相對(duì)熒光素酶活性顯著下降。相反，與NC相比，突變STAT33'-UTR不受

8、miR-17過表達(dá)的影響。這些數(shù)據(jù)表明，STAT3 mRNA和miR-17之間存在直接的相互作用。
　　結(jié)論：
　　丙泊酚能夠改善缺氧復(fù)氧后臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管內(nèi)皮損傷，這個(gè)保護(hù)作用的機(jī)制之一可能是miR-17下調(diào)介導(dǎo)的STAT3信號(hào)通路激活。
　　第二部分 丙泊酚和七氟烷兩種麻醉藥對(duì)肝臟缺血/再灌注損傷的作用
　　目的：
　　探討并比較丙泊酚和七氟烷對(duì)肝臟缺血/再灌注的作用及其確切的分子機(jī)制。
　　

9、方法：
　　1.選用雄性SD大鼠，建立肝臟缺血再灌注的模型;
　　2.采集肝臟組織，10％福爾馬林固定24小時(shí)以上，包埋后制作4μm厚度切片，然后進(jìn)行HE染色，在光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，評(píng)估炎癥和組織損傷情況;
　　3.使用生化分析儀檢測大鼠血清中的血清ALT、AST和LDH的水平，驗(yàn)證丙泊酚和七氟烷對(duì)這三種酶的作用;
　　4.利用聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測大鼠血清中炎性介質(zhì)（TNF-α，、IL-1、IL-10和IL-

10、6）的濃度和水平，以明確丙泊酚和七氟烷是否可以降低這些細(xì)胞因子的水平;
　　5.利用qRT-PCR技術(shù)檢測TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10等炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步明確丙泊酚和七氟烷對(duì)這些細(xì)胞因子的水平的作用;
　　6.利用Western blot檢測了NF-κB的水平，觀察炎性細(xì)胞因子釋放是否受NF-κB調(diào)控;
　　7.利用特定檢測試劑盒評(píng)估大鼠肝組織中氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物MDA和NO以及抗氧化標(biāo)志

11、物SOD的水平;
　　8.利用TUNEL法檢測肝組織細(xì)胞凋亡情況;
　　9.利用Western blot檢測丙泊酚和七氟烷對(duì)Bcl-2家族、AKT和p38-MAPK信號(hào)通路的影響，探究丙泊酚和七氟烷的抗凋亡機(jī)制;
　　10.利用行免疫組化染色檢測丙泊酚和七氟烷對(duì)肝臟I/R損傷大鼠的p-Akt和p-p38表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.肝組織損傷的組織學(xué)評(píng)估使用HE染色進(jìn)行。Suzuki評(píng)分顯示IR組的病理

12、改變?yōu)镮R誘導(dǎo)的重度損傷;類似地，丙泊酚和七氟烷降低了Suzuki評(píng)分，即減輕了損傷程度;
　　2.血清中釋放的幾種標(biāo)志物評(píng)估肝臟損傷，包括AST、ALT和LDH，I/R組中這些酶的水平明顯升高，但是丙泊酚和七氟烷均使這三種酶的漏出減少;
　　3.TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10等炎性因子在肝臟I/R損傷的病理生理中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了明確丙泊酚和七氟烷是否可以降低這些細(xì)胞因子的水平，使用ELISA和qRT-PCR分

13、別測定了它們?cè)诟谓M織中的水平和mRNA表達(dá)。丙泊酚和七氟烷均使TNF-α、IL-1和IL-6的釋放以及mRNA表達(dá)降低，并增加了IL-10的水平。但是，丙泊酚組的IL-1釋放顯著低于七氟烷組，而TNF-α釋放顯著高于七氟烷組;
　　4.Western blot檢測了NF-κB的表達(dá)，觀察炎性細(xì)胞因子的釋放是否受NF-κB調(diào)控。I/R誘導(dǎo)的P65磷酸化水平升高受到丙泊酚和七氟烷處理的抑制。相反，丙泊酚和七氟烷上調(diào)了IκBα的表達(dá)。丙

14、泊酚對(duì)NF-κB表達(dá)呈現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用;
　　5.測定了MDA、SOD和NO的水平，以評(píng)估丙泊酚和七氟烷對(duì)氧化應(yīng)激的影響。MDA和NO的水平于缺血再灌注時(shí)顯著增加，而丙泊酚和七氟烷處理可使其恢復(fù)。與I/R組相比，丙泊酚和七氟烷處理組的SOD水平下降;
　　6.TUNEL法檢測顯示I/R組的凋亡率顯著增加，而丙泊酚和七氟烷均使凋亡減輕;
　　7.Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí):丙泊酚和七氟烷可抑制缺血性肝損傷中Bcl

15、-2和Bcl-xl等抗凋亡蛋白的下調(diào)，而降低Bak和Bax等促凋亡蛋白的上調(diào)，最終使誘導(dǎo)肝組織凋亡的細(xì)胞色素C和caspase蛋白表達(dá)下調(diào);
　　8.Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí):丙泊酚增強(qiáng)了AKT的磷酸化而抑制了BAD的磷酸化。七氟烷顯著降低了肝臟缺血再灌注誘導(dǎo)的p38磷酸化，而AKT和BAD的總表達(dá)或磷酸化未發(fā)現(xiàn)改變;
　　9.免疫組化顯示丙泊酚增加了AKT磷酸化，而七氟烷抑制了p38的磷酸化。
　　結(jié)論及意義