七氟烷預(yù)處理對(duì)兔脊髓缺血-再灌注損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、【背景】盡管臨床上已采用多種方法減輕脊髓缺血損傷，但是胸腹主動(dòng)脈瘤手術(shù)患者不可避免發(fā)生脊髓缺血，有數(shù)據(jù)顯示3％～18％患者發(fā)生永久性損傷（急性截癱和/或延遲性截癱）。除此之外，脊髓腫瘤壓迫，脊柱畸形，椎管狹窄等患者圍手術(shù)期也會(huì)出現(xiàn)脊髓缺血/再灌注損傷。截癱造成患者失去工作能力并擔(dān)負(fù)巨額的醫(yī)療費(fèi)用，給患者本人及家庭造成深痛的打擊和巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)加重整個(gè)社會(huì)的醫(yī)療保險(xiǎn)的負(fù)擔(dān)。
　　七氟烷具有刺激性低，誘導(dǎo)、蘇醒迅速，麻醉維持平穩(wěn)

2、，肝、腎毒性低，心律失常發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床麻醉。已有研究報(bào)道，七氟烷預(yù)處理可誘導(dǎo)缺血耐受，對(duì)缺血、缺氧的心、腦起保護(hù)作用，但其對(duì)脊髓缺血/再灌注損傷是否具有保護(hù)作用尚不清楚。
　　本研究采用兔腎下腹主動(dòng)脈阻閉20min缺血/再灌注模型，研究單次七氟烷預(yù)處理是否可誘導(dǎo)快速缺血耐受，減輕脊髓缺血/再灌注損傷，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　【方法】雄性新西蘭大白兔，2.0千克～2.9千克。
　　實(shí)驗(yàn)一：隨機(jī)分為

3、2組，每組各6只動(dòng)物。I/R組動(dòng)物行20min脊髓缺血后再灌注48h。Sham組動(dòng)物接受同樣的麻醉和手術(shù)準(zhǔn)備，但不行缺血/再灌注損傷。于再灌注后4h，8h，12h，24h及48h行后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，再灌注后48h取L5節(jié)段脊髓行HE染色、p-ERK1/2染色、Fluoro-JadeB染色和TUNEL染色。計(jì)數(shù)脊髓前角正常神經(jīng)元、Fluoro-JadeB陽(yáng)性神經(jīng)元和TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元。
　　實(shí)驗(yàn)二：隨機(jī)分為4組，每組10只動(dòng)物。S

4、ev＋W1h組和Sev＋W15min組動(dòng)物面罩密閉吸入3.7％（1.0MAC）七氟烷＋96％氧氣預(yù)處理30min，分別洗脫1h或15min；O2＋W1h組和O2＋W15min組動(dòng)物面罩密閉吸入96％氧氣30min，分別洗脫1h或15min；4組動(dòng)物均行20min脊髓缺血后再灌注48h。于再灌注后4h，8h，12h，24h及48h行后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，再灌注后48h取L5節(jié)段脊髓行HE染色和脊髓前角正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)。
　　實(shí)驗(yàn)三：隨機(jī)分

5、為2大組，Sev組和O2組。Sev組動(dòng)物面罩密閉吸入3.7％（1.0MAC）七氟烷＋96％氧氣預(yù)處理30min；O2組動(dòng)物面罩密閉吸入96％氧氣30min，兩組動(dòng)物均洗脫1h后行脊髓缺血20min后再灌注。每組分別按最后觀察點(diǎn)為再灌注后8h，1d，2d，3d，5d，7d分為六組，每組6只動(dòng)物。于再灌注后8h，1d，2d，3d，5d，7d行后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，取L5節(jié)段脊髓行HE染色、Fluoro-JadeB染色和TUNEL染色。計(jì)數(shù)脊髓前

6、角正常神經(jīng)元、Fluoro-JadeB陽(yáng)性神經(jīng)元和TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元。
　　實(shí)驗(yàn)四：隨機(jī)分為4組，每組8只動(dòng)物。Vehicle+Sev組和Vehicle+O2組動(dòng)物靜脈注射溶劑DMSO50μL/kg，20min后分別吸入七氟烷和氧氣預(yù)處理；U0126+Sev組和U0126+O2組動(dòng)物靜脈注射50μL/kg0.4％U0126（溶于DMSO），20min后分別吸入七氟烷和氧氣預(yù)處理；預(yù)處理方法和兔脊髓缺血/再灌注方法同實(shí)驗(yàn)三。于再灌

7、注后4h，8h，12h，24h及48h行后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，再灌注后48h取L5節(jié)段脊髓行HE染色、Fluoro-JadeB染色和TUNEL染色。計(jì)數(shù)脊髓前角正常神經(jīng)元、Fluoro-JadeB陽(yáng)性神經(jīng)元和TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元。
　　【結(jié)果】
　　實(shí)驗(yàn)一：再灌注48h時(shí)，與Sham組相比，I/R組動(dòng)物后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分降低，脊髓前角正常神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，脊髓前角Fluoro-JadeB陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量和TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯

8、著增多（P<0.01）；脊髓組織白質(zhì)p-ERK1/2大量表達(dá)，并與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP復(fù)染，但脊髓前角神經(jīng)元沒(méi)有表達(dá)p-ERK1/2。
　　實(shí)驗(yàn)二：再灌注48h時(shí)，與O2＋W1h組相比，Sev＋W1h組動(dòng)物后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分增高，脊髓前角正常神經(jīng)元數(shù)量顯著增多（P<0.01），而Sev＋W15min組和O2＋W15min組比較差異無(wú)顯著意義（P>0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)三：再灌注后1d起，Sev組動(dòng)物后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯著高

9、于O2組（P<0.05），再灌注后2d～7d，每組動(dòng)物后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分隨時(shí)間變化無(wú)顯著差異（P>0.05）；2組動(dòng)物脊髓前角神經(jīng)元計(jì)數(shù)均從再灌注后8h開始減少，48h時(shí)計(jì)數(shù)減到最少，隨后沒(méi)有顯著變化（P>0.05），各時(shí)間點(diǎn)Sev組動(dòng)物脊髓前角正常神經(jīng)元數(shù)量顯著多于O2組（P<0.05）；Sev組動(dòng)物的脊髓前角變性神經(jīng)元計(jì)數(shù)從再灌注后8h開始從0增加，3d時(shí)計(jì)數(shù)增至最多，隨后逐漸減少；O2組動(dòng)物脊髓前角變性神經(jīng)元計(jì)數(shù)8h時(shí)已增加，至3d

10、時(shí)增至最多，隨后逐漸減少，7d時(shí)2組動(dòng)物脊髓前角Fluoro-JadeB陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)均為0，其余各時(shí)間點(diǎn)Sev組動(dòng)物脊髓前角Fluoro-JadeB陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著少于O2組（P<0.05）；2組動(dòng)物脊髓前角凋亡神經(jīng)元計(jì)數(shù)均從再灌注后8h以后開始從0增加，2d時(shí)計(jì)數(shù)增至最多，隨后逐漸減少；7d時(shí)均減至0點(diǎn)，再灌注后1d～5d時(shí)Sev組動(dòng)物脊髓前角TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著少于O2組（P<0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)四：再灌注48h

11、時(shí)，與Vehicle+O2組和U0126+Sev組相比，Vehicle+Sev組動(dòng)物后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分增高，脊髓前角正常神經(jīng)元數(shù)量顯著增多，脊髓前角Fluoro-JadeB陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量和TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（P≤0.01），而U0126+Sev組與U0126+O2組比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　【結(jié)論】
　　1.脊髓缺血20min再灌注后5d內(nèi)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)生變性和凋亡，證實(shí)神經(jīng)元變性

12、和凋亡是缺血/再灌注后脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷、死亡的重要形式。
　　2.脊髓缺血20min再灌注48h時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)陽(yáng)性，脊髓神經(jīng)元無(wú)p-ERK1/2表達(dá)。證實(shí)ERK1/2的激活在脊髓缺血/再灌注中扮演重要角色。
　　3.缺血前1h給予30min3.7％（1.0MAC）七氟烷預(yù)處理可以誘導(dǎo)快速缺血耐受，減輕兔脊髓缺血20min再灌注神經(jīng)損傷。
　　4.缺血前1h給予30min3.7％（1.0MAC）

13、七氟烷預(yù)處理誘導(dǎo)快速缺血耐受的保護(hù)效果可以持續(xù)至再灌注后7d，此時(shí)神經(jīng)元變性和凋亡均已結(jié)束，證實(shí)七氟烷預(yù)處理是通過(guò)減輕神經(jīng)損傷而不是延遲神經(jīng)損傷對(duì)脊髓缺血/再灌注起保護(hù)作用。
　　5.ERK1/2抑制劑U0126可以抑制七氟烷預(yù)處理對(duì)脊髓缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用，同時(shí)也抑制了七氟烷預(yù)處理減輕脊髓組織缺血/再灌注后前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性和凋亡的作用。一定程度上說(shuō)明七氟烷預(yù)處理通過(guò)激活ERK1/2磷酸化，抑制其下游神經(jīng)元變性和凋亡對(duì)脊髓