富氫鹽水對腦死亡豬肝臟NF-κB及Nrf2-HO-1表達(dá)的影響.pdf

1、目的：腦死亡供肝為終末期肝病患者的新生帶來了希望，對腦死亡供體器官進(jìn)行適當(dāng)維護(hù)可最大限度的利用緊缺的器官資源。氫氣的生物學(xué)作用研究近年來是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域比較熱門的一個課題，其選擇性抗氧化、抗炎癥的特性如今已在臨床得到初步的應(yīng)用，但是目前幾乎沒有關(guān)于氫氣對腦死亡大動物器官維護(hù)的研究。本研究旨在通過間斷緩慢顱內(nèi)加壓法建立五指山小型豬的腦死亡模型，并予富氫鹽水（HS）進(jìn)行干預(yù)治療。檢測腦死亡五指山小型豬經(jīng)HS干預(yù)治療后血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙

2、轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平，肝組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）含量，以及NF-κB p65、Nrf2、HO-1的表達(dá)情況，并觀察肝組織標(biāo)本光鏡及電鏡下的變化。探討HS對腦死亡肝臟損傷的干預(yù)作用及其機(jī)制，為腦死亡供肝的維護(hù)提供理論支持。
　　方法：選擇健康雄性五指山小型豬18只，隨機(jī)分為三組（n=6）：假手術(shù)組（K組）、腦死亡組（B

3、組）、HS干預(yù)組（H組）。動物經(jīng)麻醉誘導(dǎo)后依次行氣管插管、膀胱造瘺、頸動靜脈置管、顱骨鉆孔置入20F Foley氣囊導(dǎo)管。B組、H組建立腦死亡模型，并維持其腦死亡狀態(tài)24h。K組僅顱內(nèi)置入水囊，不建立腦死亡模型，維持麻醉狀態(tài)；H組動物從判斷腦死亡開始，于上腔靜脈輸入HS，B組輸入當(dāng)量的生理鹽水。B組、H組在初判腦死亡后3h、6h、12h、18h、24h分別采集血液及肝組織標(biāo)本。K組以顱內(nèi)置管后3h作為起始時間，在起始時間點后3h、6h、

4、12h、18h、24h分別采集血液及肝組織標(biāo)本。血清標(biāo)本檢測AST、ALT濃度，HE染色觀察肝組織病理學(xué)改變，電鏡觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)改變；用相應(yīng)試劑盒檢測肝組織中MDA、SOD含量；酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、 IL-6的水平；DAB免疫組織化學(xué)染色檢測各組肝組織內(nèi)6h、12h、24h，三個時間點的NF-κB p65蛋白以及Nrf2、HO-1的表達(dá)水平差異。利用Western bolt檢測肝內(nèi)

5、6h、12h、24h,NF-κBP65分子的表達(dá)量以及Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量。用SPSS20.0軟件處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)值變異均采用((-x)±S)表示，采用重復(fù)數(shù)據(jù)方差分析、單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，P＜0.05為差異有顯著性意義。
　　結(jié)果：
　　1.血清AST、ALT測定
　　K組各時間點血清ALT、AST水平差異無顯著性意義（P＞0.05）。與K組相比，B組和H組血清AST水平自3h起逐漸升高（P＜0.05

6、）， ALT水平自6小時起逐漸升高（P＜0.05）。與 B組相比，H組血清3h的AST、ALT水平無顯著性差異差（P＞0.05），6h起，H組血清AST、ALT水平顯著低于B組（P＜0.05）。
　　2.肝組織SOD、MDA測定
　　2.1 SOD測定
　　K組各時間點SOD水平差異無顯著性意義（P＞0.05）。與K組相比，3h、6h的B組、H組SOD值顯著高于K組（P＜0.05），12h、18h、24h的SOD值顯著

7、低于K組。同一時間點相比，H組SOD值顯著高于B組（P＜0.05）。
　　2.2 MDA測定
　　K組各時間點 MDA水平差異無顯著性意義（P＞0.05）。自首次判定腦死亡后3h起，B組和H組肝組織MDA水平逐漸升高（P＜0.05），相同時間點比較H組顯著低于B組（P＜0.05）。
　　3.血清IL-1β、IL-6、TNF-α測定
　　K組各時間點血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平差異無顯著性意義（P＞0.

8、05）。與K組相比，自首次判定腦死亡后3h起，B組和H組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平逐漸升高（P＜0.05），相同時間點比較H組顯著低于B組（P＜0.05）。
　　4.HE染色肝臟光鏡下變化
　　K組各時間點光鏡下肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，染色較均勻，到24h時細(xì)胞無明顯壞死、水腫、空泡化等病理變化。B組于3小時起肝細(xì)胞有輕微腫脹，12h起細(xì)胞結(jié)構(gòu)較紊亂、胞漿疏松，肝竇受壓變窄且有淤血，胞質(zhì)疏松淡染且有氣球樣變，匯

9、管區(qū)有中性粒細(xì)胞浸潤。H組相同時間點較 B組肝細(xì)胞腫脹輕微，細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對規(guī)整，炎性細(xì)胞浸潤較少，微循環(huán)通暢，肝竇淤血較輕。
　　5.透射電鏡觀察
　　K組線粒體結(jié)構(gòu)接近正常，隨著時間增加僅見線粒體脊稍有增厚融合，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張不明顯。B組自6h起可見部分線粒體脊不清晰，部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有顆粒融合、脫顆?，F(xiàn)象，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常。12h起可見線粒體水腫、空泡化，線粒體嵴部分消失，胞質(zhì)水腫，核周隙增寬，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顆粒融合。24h后可見大部

10、分線粒體嵴和膜融合，核膜不清。H組相應(yīng)時間點較 B組線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)更完整，脊清晰，且可見有自噬小體，說明細(xì)胞自我修復(fù)功能完整。
　　6.免疫組織化學(xué)檢測
　　6.1 肝組織NF-κB p65檢測
　　K組各時間點NF-κB p65水平差異無顯著性意義（P＞0.05）。與K組相比，自首次判定腦死亡后6h起，B組和H組肝組織NF-κB p65水平逐漸升高（P＜0.05），相同時間點比較H組顯著低于B組（P＜0.05）。

11、r>　　6.2 肝組織Nrf2、HO-1檢測
　　K組各時間點Nrf2、HO-1水平差異無顯著性意義（P＞0.05）。自首次判定腦死亡后6h起，B組和H組肝組織Nrf2、HO-1水平逐漸升高（P＜0.05），相同時間點比較H組顯著高于B組（P＜0.05）。
　　7.Western bolt檢測
　　7.1 肝組織NF-κB p65Western bolt檢測
　　K組各時間點NF-κB p65水平差異無顯著性意義

12、（P＞0.05）。自首次判定腦死亡后6h起，B組和H組肝組織NF-κB p65水平逐漸升高（P＜0.05），相同時間點比較H組顯著低于B組（P＜0.05）。
　　7.2 肝組織Nrf2、HO-1 Western bolt檢測
　　K組各時間點Nrf2、HO-1水平差異無顯著性意義（P＞0.05）。自首次判定腦死亡后6h起，B組和H組肝組織Nrf2、HO-1水平逐漸升高（P＜0.05），相同時間點比較H組顯著高于B組（P＜0.

13、05）。
　　結(jié)論：
　　1.利用間斷緩慢顱內(nèi)加壓法可成功建立五指山小型豬腦死亡模型，與臨床腦死亡的發(fā)展過程具有相似性，通過有效的呼吸循環(huán)及血管活性藥物等支持，能使腦死亡模型維持較長時間,可為腦死亡研究提供可靠的動物模型。
　　2.五指山小型豬在腦死亡后肝組織NF-κB表達(dá)增加，血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α濃度升高，且抗氧化應(yīng)激通路蛋白Nrf2/HO-1表達(dá)增加，組織 T-SOD水平逐漸降低，氧化應(yīng)激產(chǎn)