巴西紅耳龜紅細(xì)胞血影蛋白質(zhì)組學(xué)及對其低溫缺氧抗性機理的研究.pdf

1、龜類在動物界中屬于脊索動物門、脊椎動物亞門、爬行綱、龜鱉亞綱、龜鱉目。龜類在進(jìn)化史上屬于活化石類的生物，以長壽而聞名，具有超強的耐低溫和耐缺氧特性。耐低溫耐缺氧機理研究具有非常重要的意義，例如在細(xì)胞冷凍過程中防止細(xì)胞被冰晶損傷，在器官移植手術(shù)中，離體器官長期保存而不會出現(xiàn)缺血/缺氧而造成的衰竭，保證再充血再充氧這樣的再灌注過程中不被大量產(chǎn)生的自由基損傷，提高被遠(yuǎn)距離運送的重傷員的成活率等，甚至還有些仿生學(xué)科學(xué)家希望通過將人體通過類似的低

2、溫低氧“窖藏”的方式來延長生命。
　　 龜類具有一些非常特殊的身體結(jié)構(gòu)，其紅細(xì)胞尤為特殊。龜類紅細(xì)胞像大多數(shù)低等脊椎動物的紅細(xì)胞一樣為橢圓形，體積大且有核，不同之處在于成熟的龜類紅細(xì)胞不含有線粒體。有的研究者指出龜類紅細(xì)胞在進(jìn)化史上與哺乳動物最接近，所以，可以把龜?shù)募t細(xì)胞定位于低等脊椎動物與高等脊椎動物紅細(xì)胞之間。但是到目前為止，科學(xué)界對龜類紅細(xì)胞的組成，尤其是對細(xì)胞保護(hù)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，物質(zhì)運輸有重要意義的細(xì)胞膜的組成知之甚少。如此

3、特殊的紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其與龜類超強的抗缺氧抗應(yīng)激耐力的關(guān)系是本研究探討的關(guān)鍵科學(xué)問題。本文以蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)技術(shù)對巴西紅耳龜血影的全蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)了一些與巴西紅耳龜?shù)蜏厝毖跄褪苤苯酉嚓P(guān)的蛋白，進(jìn)而研究了其在巴西紅耳龜?shù)蜏厝毖踹^程中可能發(fā)揮的作用及作用機理。
　　 首先，本文以巴西紅耳龜（Red-earedturtle，Trachemysscripta）為研究材料，著眼于如何獲得高純度的巴西紅耳龜紅細(xì)胞血影，由于巴西紅耳

4、龜紅細(xì)胞既有類似體細(xì)胞的復(fù)雜性，其細(xì)胞膜又具有哺乳動物紅細(xì)胞的脆弱性，以至于分離體細(xì)胞的劇烈細(xì)胞破碎方法和分離哺乳動物紅細(xì)胞的相對溫和的低滲裂解法都不適用于分離龜類的紅細(xì)胞。所以，純化其紅細(xì)胞血影是一項挑戰(zhàn)。在本研究之前，未發(fā)現(xiàn)有詳細(xì)的關(guān)于如何分離純化巴西紅耳龜紅細(xì)胞血影的方法。本實驗室在已有的研究報道的基礎(chǔ)上通過反復(fù)摸索，最終總結(jié)出了一套有效的分離方法，通過富集紅細(xì)胞，低滲裂解，具特殊針頭注射器的吹打，低速勻漿以及差速離心的方法，我們

5、最終獲得了滿足蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定要求的血影。并通過4種不同的樣品前處理與不同的質(zhì)譜鑒定方法相結(jié)合，介紹了一套有效的巴西紅耳龜紅細(xì)胞血影的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，共鑒定得到169個非冗余蛋白質(zhì)并對其中有意義的蛋白質(zhì)進(jìn)行了深入的探討，發(fā)現(xiàn)了一些與巴西紅耳龜超強耐力相關(guān)的蛋白，如微管蛋白，熱休克蛋白，以及定位在“紅細(xì)胞膜上”的與產(chǎn)能直接相關(guān)的蛋白——F型ATP合酶亞單位。紅細(xì)胞“非線粒體微生物樣供能”為巴西紅耳龜?shù)目鼓嫔鏅C理研究打開了一個全新的視野

6、。
　　 其次，我們對巴西紅耳龜進(jìn)行了一周低溫潛水處理，測定了一些與能量代謝相關(guān)的關(guān)鍵生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)了巴西紅耳龜在短期低溫潛水期間無氧糖酵解與糖異生同時進(jìn)行的能量代謝方式。對短期低溫潛水期間巴西紅耳龜體內(nèi)肝糖原和肌糖原儲備沒有被消耗而血糖升高的現(xiàn)象作出了獨特的闡釋。
　　 最后，我們結(jié)合短期低溫潛水期間能量代謝的特點以及前人的研究基礎(chǔ)，進(jìn)行了血液體外ATP剝奪實驗，證實了巴西紅耳龜紅細(xì)胞具有向細(xì)胞外產(chǎn)生ATP的特性?？赡?/p>

7、的產(chǎn)能機理是紅細(xì)胞利用細(xì)胞內(nèi)比細(xì)胞外高出約5倍的氫離子推動細(xì)胞膜上的ATP合酶合成ATP。并在此基礎(chǔ)上提出了巴西紅耳龜短期低溫潛水期間的能量代謝模型假說。
　　 總之，本研究從巴西紅耳龜血影的分離純化到血影蛋白的高效酶切，再到質(zhì)譜鑒定，生物信息學(xué)分析，系統(tǒng)地提出了一套針對巴西紅耳龜甚至是有核紅細(xì)胞血影的組學(xué)分析方法。同時，對巴西紅耳龜短期低溫缺氧能量代謝機理進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)巴西紅耳龜紅細(xì)胞除了攜帶氧的作用外，還可能具有供能作用。