成年鼠背毛毛乳頭細(xì)胞分離方法的建立與評價.pdf

1、隨著組織工程與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，構(gòu)建組織工程毛囊將會是治療禿發(fā)較有前景的方法。毛乳頭細(xì)胞(DPCs)是毛囊再生重要的種子細(xì)胞。但是，DPCs經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后其誘導(dǎo)能力逐漸喪失。許多方法用于維持或者恢復(fù)體外培養(yǎng)的DPCs的誘導(dǎo)能力。但是，短時間內(nèi)要獲取足夠數(shù)量的且具有誘導(dǎo)能力的DPCs仍比較困難。目前，組織工程毛囊的研究均處于實驗階段，DPCs通常來源于小鼠的觸須毛囊或者是手術(shù)廢棄的人頭皮毛囊，其來源非常有限。因此，嘗試分離并培養(yǎng)小鼠背毛D

2、PCs以期提供一種新的DPCs來源。
　　目的：
　　(1)分離、培養(yǎng)C57小鼠背毛DPCS.
　　(2)檢測體外培養(yǎng)的C57小鼠背毛DPCs誘導(dǎo)能力.
　　(3)探討培養(yǎng)的背毛DPCs用于毛囊重建的可行性.
　　方法：
　　(1)C57小鼠背毛DPCs的分離與培養(yǎng)
　　取5w C57BL/6小鼠背部皮膚，經(jīng)酶消化及Ficoll密度梯度離心后分離獲取毛乳頭(DP)，顯微鏡下觀察DP外觀、貼壁及細(xì)

3、胞遷出情況，計算DP貼壁率。觀察傳代細(xì)胞生長情況。
　　(2)體外培養(yǎng)的C57小鼠背毛DPCs誘導(dǎo)能力的檢測
　　取P3代的小鼠背毛DPCs、觸須DPCs及真皮成纖維細(xì)胞(Fbs)，分別采用qRT-PCR、免疫熒光。
　　(3)體外培養(yǎng)的背毛DPCs用于毛囊重建
　　分別取P3代小鼠背毛DPCs、觸須DPCs及Fbs結(jié)合新生鼠上皮細(xì)胞用于毛囊重建。分別于移植后4周對移植部位進(jìn)行組織取材，對移植部位進(jìn)行大體觀察、組

4、織切片H&E染色觀察。
　　結(jié)果：
　　(1)C57小鼠背毛DPCs的分離與培養(yǎng)
　　經(jīng)酶消化及Ficoll密度梯度離心后獲取的DP呈圓形或橢圓形，24h貼壁率達(dá)90％。傳代后的DPCs呈明顯長梭形，漩渦樣生長，隨著傳代次數(shù)增加，DPCs逐漸失去凝集性生長能力。
　　(2)體外培養(yǎng)的C57小鼠背毛DPCs誘導(dǎo)能力的檢測
　　qRT-PCR、免疫熒光染色檢測結(jié)果表明：體外培養(yǎng)的小鼠背毛DPCs可表達(dá)ALP、β

5、-catenin和Versican在內(nèi)的與誘導(dǎo)能力相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記物基因及蛋白，且與觸須DPCs表達(dá)無明顯差異，與Fbs表達(dá)有明顯差異。
　　(3)體外培養(yǎng)的背毛DPCs用于毛囊重建
　　將Fbs與新鮮表皮細(xì)胞聯(lián)合移植或者僅表皮細(xì)胞單獨移植均未能重建出毛囊。將培養(yǎng)的背毛DPCs或者觸須DPCs與新鮮表皮細(xì)胞聯(lián)合移植后均能重建出毛囊。
　　結(jié)論：
　　(1)通過酶消化結(jié)合Ficoll梯度離心法可分離獲得小鼠背毛DP，