（一）重組Irisin蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管新生及其機(jī)制研究（二）二氫楊梅素對(duì)順鉑引起腎損傷的保護(hù)性作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 Irisin通過(guò)激活ERK信號(hào)通路，誘導(dǎo)體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以及體內(nèi)斑馬魚(yú)的血管新生
　　研究背景:
　　血管新生，是由已有的脈管系統(tǒng)中生成新的血管，這需要內(nèi)皮細(xì)胞一系列的協(xié)調(diào)活動(dòng)，例如增殖、遷移、結(jié)合形成血管樣的管腔結(jié)構(gòu)。這一過(guò)程是發(fā)生血管損傷后組織修復(fù)的關(guān)鍵步驟。已有多種疾病被證實(shí)可以引起脈管系統(tǒng)的損傷，最常見(jiàn)的有心血管疾病及慢性代謝性疾病，尤其是糖尿病的大血管及微血管并發(fā)癥。因此，修復(fù)受損的內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)受損

2、處的血管新生，在治療多種疾病引發(fā)的血管損傷方面具有十分重要的意義。此前，已有大量關(guān)于內(nèi)源性因素以及激素參與調(diào)節(jié)血管新生的報(bào)道。
　　長(zhǎng)期以來(lái)，大量研究表明適量有氧運(yùn)動(dòng)能夠有效預(yù)防和延緩多種心血管疾病和慢性代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展。2012年哈佛大學(xué)Spiegelman實(shí)驗(yàn)室的最新研究發(fā)現(xiàn)了一種新的肌肉因子—Irisin，Irisin是經(jīng)蛋白水解酶切除Ⅲ型纖連蛋白組件包含蛋白5（fibronectin typeⅢ domain-cont

3、aining protein5，F(xiàn)NDC5）的N端信號(hào)肽后形成的約110個(gè)氨基酸大小的可分泌多肽片段。作為運(yùn)動(dòng)和代謝之間的聯(lián)系，Irisin被認(rèn)為具有增加體能消耗，減少身體重量，以及增加小鼠的胰島素敏感性等多種作用。
　　在我們的前期研究結(jié)果中，我們闡明了Irisin具有經(jīng)由ERK信號(hào)通路促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，同時(shí)它能夠部分性地保護(hù)細(xì)胞，使其免受高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。我們的這些發(fā)現(xiàn)表明，Irisin和血管內(nèi)皮細(xì)

4、胞之間存在一定的聯(lián)系。然而，目前尚未有研究證明Irisin是否直接參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的其他功能，如遷移和血管新生，其中可能涉及的分子機(jī)制及信號(hào)傳遞系統(tǒng)也尚未可知。
　　研究目的:
　　1.體外實(shí)驗(yàn)部分旨在探討重組Irisin蛋白對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管新生的影響，并探尋此過(guò)程可能會(huì)涉及到的分子機(jī)制及信號(hào)通路。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分旨在進(jìn)一步證實(shí)重組Irisin蛋白對(duì)斑馬魚(yú)節(jié)間血管的血管新生存在促進(jìn)作用。
　

5、　研究方法:
　　1.重組Irisin蛋白的表達(dá)純化;
　　2.原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離提取與體外培養(yǎng);
　　3.通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組Irisin蛋白對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力的影響;
　　4.通過(guò)細(xì)胞新生管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組Irisin蛋白對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成能力的影響;
　　5.通過(guò)斑馬魚(yú)節(jié)間血管生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組Irisin蛋白對(duì)斑馬魚(yú)損傷的節(jié)間血管新生能

6、力的影響;
　　6.通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)重組Irisin蛋白處理后參與此過(guò)程的相關(guān)基因的表達(dá)情況;
　　7.通過(guò)Western印跡分析檢測(cè)重組Irisin蛋白處理后參與此過(guò)程的相關(guān)信號(hào)通路及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)情況;
　　8.通過(guò)明膠酶譜法檢測(cè)重組Irisin蛋白處理后基質(zhì)金屬蛋白酶的活性;
　　9.統(tǒng)計(jì)分析所得結(jié)果，采用t檢驗(yàn)比較不同組之間的差異;采用單向方差分析(ANOVA)比較不同試驗(yàn)組之間的數(shù)據(jù)。P

7、＜0.05的差異被視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.Irisin促進(jìn)入臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移:
　　(1)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，在使用10 nM和20 nM兩個(gè)不同濃度的重組Irisin蛋白處理細(xì)胞12和24 h的實(shí)驗(yàn)組中，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移速度明顯加快，且表現(xiàn)出Irisin劑量依賴(lài)效應(yīng)。
　　(2) Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，在使用10nM和20 nM兩個(gè)不

8、同濃度的重組Irisin蛋白處理24 h后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的遷移能力，并同樣表現(xiàn)出Irisin濃度依賴(lài)效應(yīng)。
　　2.細(xì)胞新生管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，10 nM和20 nM兩個(gè)不同濃度的重組Irisin蛋白處理細(xì)胞6h均能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成，且重組Irisin蛋白濃度為20 nM組的小管形成數(shù)量和密度均更為明顯。
　　3.斑馬魚(yú)節(jié)間血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組Irisin蛋白能夠減弱PT

9、K787化學(xué)誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)節(jié)間血管損傷，并促使被抑制的節(jié)間血管重新生長(zhǎng)。
　　4.Irisin上調(diào)MMP-2以及MMP-9表達(dá)和活性:
　　(1)實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果表明，重組Irisin蛋白處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和斑馬魚(yú)24 h后，均能夠顯著刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-2和MMP-9基因的表達(dá)，并略微降低TIMP-1基因的表達(dá)。
　　(2) Western印跡結(jié)果顯示，重組Irisin蛋白處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后

10、，MMP-2和MMP-9在蛋白水平表達(dá)也顯著上調(diào)。
　　(3)明膠酶譜分析處理后發(fā)現(xiàn)，重組Irisin蛋白可以增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌的MMP-2和MMP-9的活性。
　　5.Irisin通過(guò)ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和新生管腔形成:
　　(1) Western印跡結(jié)果顯示，經(jīng)重組Irisin蛋白處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞5 min及10 min的時(shí)間點(diǎn)，P-ERK的表達(dá)顯著升高。
　　(2)用ERK的特

11、異性抑制劑U0126處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，Irisin誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和管腔形成被顯著抑制。
　　6.ERK抑制劑對(duì)Irisin誘導(dǎo)的MMP-2以及MMP-9表達(dá)和活性的影響
　　(1) Western印跡結(jié)果顯示，U0126處理后，Irisin誘導(dǎo)的MMP-2以及MMP-9的表達(dá)被顯著抑制。
　　(2)明膠酶譜分析顯示，U0126處理后，Irisin誘導(dǎo)的MMP-2以及MMP-9的活性同樣被顯著抑制。
　　結(jié)論

12、:
　　1.重組Irisin蛋白能夠促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及新生管腔形成。
　　2.重組Irisin蛋白能夠減輕PTK787誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)節(jié)間血管的損傷。
　　3.ERK MAPK信號(hào)通路參與重組Irisin蛋白調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能及MMP-2/MMP-9的表達(dá)和活性。
　　關(guān)鍵詞:重組Irisin蛋白;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;斑馬魚(yú);血管新生
　　第二部分二氫楊梅素通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)減輕順鉑誘導(dǎo)的腎毒性損傷

13、>　　研究背景:
　　順式-二氯二氨合鉑(Ⅱ)(cis-Dichlorodiamineplatinum(Ⅱ)，臨床稱(chēng)之為順鉑），屬于鉑類(lèi)抗癌藥物。它與多種抗腫瘤藥物有協(xié)同作用，是多種實(shí)體腫瘤的一線化療藥物之一，常用于治療頭頸部癌、小細(xì)胞與非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、睪丸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等多種鱗狀上皮癌和惡性淋巴瘤。然而，順鉑在具有高效廣譜抗癌活性的同時(shí)，也會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用，其中最主要的是其引起的劑量相關(guān)性腎臟毒性。嚴(yán)

14、重時(shí)會(huì)引起不可逆性的腎功能障礙及腎小管壞死。目前順鉑引起腎毒性的具體病理機(jī)制尚未完全明確，但廣泛認(rèn)為，腎小管上皮細(xì)胞攝入順鉑后會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的激活和炎癥因子的大量釋放，這是導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞壞死及腎臟組織損傷的主要原因。
　　二氫楊梅素是從葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata，即藤茶）的葉片中提取出的主要活性成分，為天然黃酮類(lèi)化合物。藤茶的莖葉被用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛等病癥在我國(guó)已有

15、數(shù)百年歷史。以往的研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素具有多種藥用功效，包括抗氧化和清除氧自由基的作用。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素能夠有效地減少抗癌藥多柔比星（也稱(chēng)阿霉素）造成的大鼠原代心肌細(xì)胞的凋亡與活性氧的釋放，從而緩解急性心肌毒性并部分恢復(fù)心臟功能。但尚未有研究證明二氫楊梅素對(duì)順鉑引起的腎毒性損傷是否同樣有保護(hù)性作用。
　　因此根據(jù)以往的研究結(jié)果，我們建立了順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的模型，觀察二氫楊梅素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的腎組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和氧化應(yīng)激

16、反應(yīng)的抑制作用，以及二氫楊梅素對(duì)順鉑引起的腎小管上皮細(xì)胞HK-2凋亡及壞死的保護(hù)性作用。
　　研究目的:
　　1.觀察二氫楊梅素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡和壞死的影響。
　　2.建立順鉑誘導(dǎo)C57/BL6小鼠急性腎損傷模型，觀察二氫楊梅素對(duì)小鼠模型的保護(hù)性作用，并探討其中可能涉及的保護(hù)性機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.WST-1和DAPI染色檢測(cè)HK-2細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡細(xì)胞數(shù)量;
　　2.We

17、stern blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平
　　3.建立順鉑誘導(dǎo)的C57/BL6小鼠急性腎損傷模型;
　　4.檢測(cè)小鼠血清肌酐和尿素氮水平;
　　5.檢測(cè)腎組織內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物的水平;
　　6.PAS和HE染色觀察腎組織的大體形態(tài)以及腎組織內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況;
　　7.免疫組織化學(xué)染色觀察腎組織內(nèi)DNA損害標(biāo)志物的表達(dá)情況;
　　8.TUNEL染色檢測(cè)腎組織內(nèi)凋亡細(xì)胞的數(shù)量;
　　9.實(shí)

18、時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)腎組織內(nèi)炎癥因子基因的表達(dá)水平;
　　10.統(tǒng)計(jì)分析所得結(jié)果，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。采用t檢驗(yàn)比較不同組之間的差異;采用單向方差分析(ANOVA)比較不同試驗(yàn)組之間的數(shù)據(jù)。P＜0.05的差異被視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.二氫楊梅素保護(hù)順鉑引起的HK-2細(xì)胞凋亡:
　　(1) WST-1檢測(cè)細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與順鉑單處理組相比，50μM二氫楊梅素共處理組細(xì)胞的增殖抑制率較低。

19、
　　(2) DAPI染色結(jié)果顯示，與順鉑單處理組相比，50μM二氫楊梅素共處理組的細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少。
　　(3) Western blot結(jié)果顯示，與順鉑單處理組相比，二氫楊梅素下調(diào)了促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，上調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平。
　　2.二氫楊梅素緩解了順鉑導(dǎo)致的腎臟毒性:
　　(1)檢測(cè)不同組小鼠的血清尿素氮和血清肌酐結(jié)果顯示，單次順鉑注射3天后血清尿素氮和肌酐均顯著升高，而二氫楊梅素(

20、500 mg/kg)與順鉑共處理組的結(jié)果有部分好轉(zhuǎn)，并表現(xiàn)出二氫楊梅素濃度依賴(lài)效應(yīng)。
　　(2) PAS染色結(jié)果顯示，順鉑單處理組小鼠腎小管出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)破壞和腎小管管型形成，而二氫楊梅素（500 mg/kg）與順鉑共處理組有明顯好轉(zhuǎn)。
　　(3) TUNEL染色結(jié)果顯示，與順鉑單處理組相比，二氫楊梅素共處理組TUNEL陽(yáng)性胞核數(shù)目明顯減少。
　　3.二氫楊梅素對(duì)順鉑引起的氧化應(yīng)激的保護(hù)性作用:
　　(1)8-O

21、HdG免疫組化染色結(jié)果顯示，與順鉑單處理組相比，二氫楊梅素共處理組陽(yáng)性胞核數(shù)目明顯減少。
　　(2)對(duì)腎組織內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果顯示，與順鉑單處理組相比，二氫楊梅素共處理組MDA的水平有所下降，而SOD、CAT的水平有所升高。
　　4.二氫楊梅素抑制順鉑引起的炎癥標(biāo)志物的表達(dá):
　　(1)與順鉑單處理組相比，二氫楊梅素共處理組可以顯著降低炎癥因子IL-1β、TNF-α、MCP-1的mRNA表達(dá)水平。
　　(