利用轉(zhuǎn)基因RNAi分析果蠅中泛素連接酶E3s以及基因CG4911的敲除.pdf

1、目的:泛素是真核生物中普遍存在并在進(jìn)化過程中高度保守的一類蛋白質(zhì),泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是真核細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)調(diào)控系統(tǒng),參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞增生與分化,以及信號(hào)傳導(dǎo)等多種細(xì)胞生理過程,因此細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泛素化降解是蛋白質(zhì)重要的轉(zhuǎn)錄后修飾方式之一。選取果蠅為研究模型研究泛素連接酶E3基因敲除后對(duì)果蠅的發(fā)育影響,建立CG4911基因敲除果蠅株。
　　 方法:首先利用網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)生物信息工具--SMART(simple modular

2、architectureresearch tool)篩選果蠅基因組中潛在的泛素連接酶E3基因,并利用Loss-of-Fuction分析這些基因的作用。候選的E3基因利用ds-RNA介導(dǎo)的干擾使其沉默,觀察果蠅成蟲眼和翅膀的表現(xiàn)型,并用免疫熒光染色Wing disc觀察細(xì)胞信號(hào)通路基因的表達(dá)情況。用連有這些基因的載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,染色后觀察基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置。最后以P轉(zhuǎn)座因子為工具敲除基因,以便于進(jìn)行更加深入的分析。
　　

3、 結(jié)果:通過SMART-工具篩選出200個(gè)潛在的泛素連接酶E3基因,經(jīng)過RNAi篩選分析后確定了15個(gè)候選基因進(jìn)行敲除。RNAi沉默CG4911后果蠅成蟲表現(xiàn)為強(qiáng)烈的翅膀和眼缺陷；免疫熒光染色的結(jié)果顯示W(wǎng)g和Dpp的信號(hào)通路受到破壞。獲得CG4911敲除果蠅本論文主要介紹其中之一的基因CG4911的工作。
　　 結(jié)論:泛素連接酶E3基因通過調(diào)節(jié)各細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)揮在果蠅發(fā)育中的調(diào)節(jié)
　　 作用；基因CG4911可能通過對(duì)D