灌注式培養(yǎng)復方殼多糖組織工程皮膚流速及營養(yǎng)條件的初步研究.pdf

1、皮膚是人體最重要的防御屏障，但因其直接與外界環(huán)境接觸，也最易受到各種損傷和疾病的傷害從而導致皮膚缺損，除了常規(guī)療法外，可以使用組織工程皮膚來修復。復方殼多糖組織工程皮膚作為一個較理想的三維模型，一直采用傳統的靜態(tài)培養(yǎng)方式，雖然技術已較為成熟，仍面臨培養(yǎng)時間較長、工作量大、偶有污染等缺點。而新興的灌注式培養(yǎng)這一動態(tài)培養(yǎng)的方法可以避免諸多靜態(tài)培養(yǎng)無法避免的問題。目前已研制的灌注式培養(yǎng)模式有五層重疊式、MINUTH灌注式培養(yǎng)等方法，但是對培養(yǎng)

2、的細胞有較強的針對性，應用相對局限，且培養(yǎng)出的細胞與靜態(tài)培養(yǎng)相比活力比較接近，優(yōu)勢并不是十分突出。我們在本次實驗中使用的灌注設備是我們自行研制的疊層式生物反應器，在進一步改進、優(yōu)化后以求能達到更好的細胞培養(yǎng)效果。通過初步采用灌注式培養(yǎng)方法培養(yǎng)了組織工程皮膚，采用不同灌注流速比較組織工程真皮的細胞增殖情況，研究不同營養(yǎng)濃度對組織工程皮膚形態(tài)結構及細胞增殖凋亡的影響，為進一步改善灌注培養(yǎng)條件提供更多依據，為灌注式培養(yǎng)在組織工程皮膚方面的深入

3、應用打下了基礎。
　　目的:
　　1、簡要分析、比較目前我們采用的灌注式培養(yǎng)器低流速與高流速流場的均勻性與剪切力。
　　2、研究不同灌注流速對組織工程皮膚真皮細胞增殖的影響，初步摸索出較適合組織工程真皮動態(tài)培養(yǎng)的灌注速度。
　　3、比較不同營養(yǎng)濃度對組織工程雙層皮膚形態(tài)結構及細胞增殖凋亡的影響，摸索較適宜細胞生長的營養(yǎng)濃度條件。
　　方法:
　　1、利用計算流體動力學(Computational Fl

4、uid Dynamics，CFD)，采用兩相流模型進行三維流場計算模擬，進行流場均勻性與剪切力的分析。
　　2、酶消化分離青年男性包皮標本獲得成纖維細胞，并進行培養(yǎng)、傳代，使用第2代成纖維細胞構建復方殼多糖組織工程真皮。在低流量(80ml/min)及高流量(800ml/min)的灌注速度條件下培養(yǎng)復方殼多糖組織工程真皮，用MTT法檢測兩個流速狀態(tài)下真皮細胞的存活和增殖情況，并做統計學分析。
　　3、使用第2代角質形成細胞構建

5、含表真皮的復方殼多糖組織工程雙層皮膚。將其分別置于含40％及80％低糖DMEM的培養(yǎng)基下進行灌注式培養(yǎng)，分別于5天及10天取材，進行HE染色觀察細胞形態(tài)，利用ki67檢測細胞增殖情況，TUNEL染色檢測細胞凋亡，計數陽性細胞數并作統計學分析。
　　結果:
　　1、我們研制的灌注設備結構在流量較低時（如80ml/min時），營養(yǎng)液速度、動靜壓、流場漩渦度、速度梯度、流場矢量等指標能夠保證很好的均勻性。當流量增大時，全場流速增大

6、，動靜壓也有不同程度增高，流場失去均勻性特性。
　　2、MTT的結果顯示隨著培養(yǎng)時間的延長，低流速灌注條件下組織工程真皮內的MTT值隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，提示真皮內的活細胞數不斷增加，細胞處于持續(xù)增殖狀態(tài)。另外，低流速灌注培養(yǎng)下的細胞活力顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)。而高流速灌注情況下的細胞活力較靜態(tài)培養(yǎng)差。
　　3、低流速灌注培養(yǎng)的組織工程皮膚細胞在HE染色下形態(tài)較好，真表皮雙層結構清晰，表明在灌注培養(yǎng)下，組織工程皮膚仍能獲得較好

7、的營養(yǎng)供應。
　　4、免疫組化檢測ki67的結果顯示:表皮和真皮內的ki67陽性細胞數在80％濃度的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)時都顯著高于40％濃度的DMEM培養(yǎng)基(P＜0.05)。與80％濃度培養(yǎng)5d相比，80％濃度培養(yǎng)10d時真皮層內ki67陽性細胞數，顯著減少(P＜0.05)。
　　5、用TUNEL檢測培養(yǎng)基的濃度對雙層組織工程皮膚內細胞凋亡的影響，經統計，真皮和表皮內凋亡細胞數量表明40％濃度DMEM培養(yǎng)組顯著高于80％濃度