復(fù)方殼多糖組織工程皮膚基底膜重建的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、皮膚基底膜是位于表皮與真皮之間的一條厚約0.5～1.0μm的重要結(jié)構(gòu)，具有許多重要生物學(xué)功能，最明顯的功能是緊密連接表皮與真皮，為表皮和真皮提供有力的結(jié)合力，避免生理條件下表皮的分離；另一個顯著作用是確定表皮細(xì)胞的極性，提供表皮移行的屏障。在正常環(huán)境中，基底膜可抑制表皮細(xì)胞與真皮的直接接觸。此外，還具有滲透和屏障等作用，在保持皮膚的完整性中起著不可替代的作用。 皮膚基底膜主要由Ⅳ型和Ⅶ型膠原、LN(LN-5、6和10)、巢蛋白和

2、基底膜蛋白多糖等多種成分組成。Ⅳ型膠原和LN是基底膜的兩個主要組成成分，Ⅳ型膠原形成一級網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提供顯著的機(jī)械穩(wěn)定性，LN結(jié)合到Ⅳ型膠原與巢蛋白等相互作用形成二級網(wǎng)絡(luò)。在超微結(jié)構(gòu)上，基底膜可大致分為三層，即透明板、致密板和纖維網(wǎng)層。透明板是位于致密板和形成高電子密度斑塊即半橋粒的基底層細(xì)胞之間的區(qū)域。錨絲主要由LN-5聚集于透明板形成，與皮膚的半橋粒相對應(yīng)。致密板主要由Ⅳ型膠原、LN和基底膜蛋白多糖組成的層狀結(jié)構(gòu)。纖維網(wǎng)層位于致密板下

3、，含有原纖維，位于表真皮連接的主要由Ⅶ型膠原組成的錨原纖維。 表真皮易于分離是目前雙層組織工程皮膚的重要缺陷，其根本原因就是因?yàn)楸碚嫫らg沒有構(gòu)建完整的基底膜。即使形成了基底膜，其結(jié)構(gòu)也不連續(xù)，表真皮結(jié)合能力不能適應(yīng)操作需要。表真皮細(xì)胞的相互作用可以促進(jìn)基底膜的成分蛋白如Ⅳ型、Ⅶ型膠原、巢蛋白、LN等大分子的合成，并形成多層次網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，共同維持表真皮連接的穩(wěn)定性。 皮膚替代物中致密層形成的形態(tài)學(xué)順序如下： (1)沿

4、著基底細(xì)胞內(nèi)側(cè)出現(xiàn)半橋粒結(jié)構(gòu)； (2)局部出現(xiàn)與半橋粒以錨絲相連的致密板； (3)致密層側(cè)向延長。其中，半橋粒結(jié)構(gòu)可能會作為皮膚替代物的核心來促進(jìn)基底膜的形成，并且半橋粒結(jié)構(gòu)因加入LN-5而獲得的增加量可以加速皮膚替代物的基底膜裝配。 LN-5是一種促進(jìn)KC粘附非常有效的物質(zhì)。LN-5定位于跨越透明板的錨絲。在體內(nèi)，LN-5被證實(shí)是在真表皮連接中橋聯(lián)基底層細(xì)胞和致密板的錨絲的的主要組成成分。目前已有學(xué)者利用在培養(yǎng)

5、系統(tǒng)中加入外源性LN-5，促進(jìn)表真皮間基底膜的形成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在皮膚替代物中加入外源性LN-5的作用，可以促進(jìn)致密板的形成，并呈濃度依賴性。 本實(shí)驗(yàn)利用復(fù)方殼多糖組織工程皮膚技術(shù)平臺，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的鈣濃度影響KC與FB的相互作用，促進(jìn)基底膜的形成；不同時相加入不同濃度的外源性LN，觀察基底膜形成情況；首次將力學(xué)環(huán)境引入組織工程皮膚研究，模擬在體力學(xué)環(huán)境，對培養(yǎng)的組織工程皮膚進(jìn)行垂直應(yīng)力作用，觀察種子細(xì)胞生物學(xué)行為改變后基底膜形

6、成的情況；采用H.E.染色、PAS染色、Ⅳ型膠原、Ⅶ型膠原、CK14、LN等免疫組化染色、電鏡等方法，觀察基底膜構(gòu)建情況；在此基礎(chǔ)上，采用免疫印跡蛋白表達(dá)分析，測定陳舊培養(yǎng)基中游離LN-5的含量情況，探討LN-5在構(gòu)建組織工程皮膚基底膜中的作用；建立平板流動腔模型，對重建了基底膜的組織工程皮膚進(jìn)行流體剪切力的作用，觀察組織工程皮膚對剪切應(yīng)力的耐受情況，初步評價組織工程皮膚的物理性能；將組織工程皮膚移植于動物全層創(chuàng)面，觀察移植物覆蓋創(chuàng)面情

7、況。 本實(shí)驗(yàn)獲得如下主要研究結(jié)果： (1)通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基鈣濃度和加入外源性LN，成功構(gòu)建結(jié)構(gòu)良好的基底膜，發(fā)現(xiàn)高鈣環(huán)境和在培養(yǎng)7天后加LN更有助于基底膜的形成，加入高濃度的LN形成的基底膜要明顯優(yōu)于低濃度組； (2)首次建立組織工程皮膚的垂直應(yīng)力作用模型，通過不同的應(yīng)力作用，發(fā)現(xiàn)每天1次，持續(xù)15～30min的垂直應(yīng)力作用，有助于基底膜體外重建； (3)構(gòu)建了基底膜的組織工程皮膚，其表真皮間Ⅳ型膠原、Ⅶ型

8、膠原及LN的免疫組化反應(yīng)陽性，表皮下部分CK14染色呈陽性反應(yīng)； (4)電鏡下可見表真皮間有數(shù)目不等的半橋粒形成，尤以垂直應(yīng)力作用后的組織工程皮膚明顯； (5)陳舊培養(yǎng)基中游離LN-5的測定，結(jié)果提示垂直應(yīng)力作用可促進(jìn)KC分泌LN-5，低鈣環(huán)境有利于KC增殖并合成LN-5，加入外源性LN可有效提高游離LN-5的濃度； (6)構(gòu)建了基底膜的組織工程皮膚，可以抵抗一定的剪切應(yīng)力，尤以經(jīng)過垂直應(yīng)力作用的組織工程皮膚為佳

9、；(7)組織工程皮膚可有效修復(fù)動物全層皮膚缺損創(chuàng)面。 本研究通過在培養(yǎng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)鈣濃度，添加外源性LN，成功地構(gòu)建了基底膜結(jié)構(gòu)，利用H.E.染色、PAS染色、免疫組化、電鏡等技術(shù)，評價基底膜的組織學(xué)結(jié)構(gòu)及重建水平；對LN在組織工程皮膚基底膜重建中的中心作用進(jìn)行了有益的探索，明確了LN在基底膜分子網(wǎng)絡(luò)形成中的重要地位；模擬在體毛細(xì)血管壓力的力學(xué)環(huán)境，觀察了垂直應(yīng)力作用對基底膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)給予垂直應(yīng)力有利于基底膜的重建，并在增加

10、半橋粒的數(shù)目上有明顯作用；利用平板流動腔模型，對獲得的重建了基底膜的組織工程皮膚進(jìn)行初步的力學(xué)評價。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，進(jìn)行組織工程皮膚器官型培養(yǎng)，培養(yǎng)基鈣濃度以1.95mM為宜，LN添加以20μg/ml為宜，且加入的最佳時間是在培養(yǎng)7天后，組織工程皮膚分層分化最好的時間在培養(yǎng)15天左右。本研究首次提出了優(yōu)化培養(yǎng)條件的方案，證實(shí)了LN-5在重建基底膜中的中心作用；首次在組織工程皮膚研究中引入力學(xué)因素，證實(shí)了力學(xué)環(huán)境因素對體外構(gòu)建基