復方殼多糖組織工程真皮抗張強度的影響因素及其促血管生成活性的初步研究.pdf

1、目的：1、應用高敏度小張力膜狀生物材料力學性能測定儀檢測不同支架材料和不同成纖維細胞數量的組織工程真皮的抗張強度。2、研究體外分離、培養(yǎng)、凍存人臍靜脈內皮細胞的有效方法以獲得大量人臍靜脈內皮細胞，探討其為構建含血管的組織工程皮膚提供種子細胞的可能性。3、研究組織工程皮膚培養(yǎng)液中血管內皮細胞生長因子(VEGF)的分泌情況。4、檢測復方殼多糖組織工程真皮條件培養(yǎng)基促進臍靜脈內皮細胞增殖的能力。 方法：1、分別培養(yǎng)含有不同數量成纖維細

2、胞的膠原凝膠和復方殼多糖真皮替代物，15天后檢測抗張強度。2、新鮮臍帶內灌注膠原酶消化，獲得內皮細胞，用含20％胎牛血清的M199液進行培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，結合Ⅷ因子免疫組化鑒定細胞來源。內皮細胞加入10％甘油的凍存液，分別置于液氮保存1周和4周，復蘇后血球計數板計數，繪制生長曲線。3、收集不同時相的單層成纖維細胞培養(yǎng)液、膠原凝膠真皮替代物(膠原凝膠DE)、膠原凝膠皮膚替代物(膠原凝膠SE)、復方殼多糖真皮替代物(復方殼多糖D

3、E)、復方殼多糖皮膚替代物(復方殼多糖SE)培養(yǎng)液樣本，雙抗體夾心ELISA法測定其中VEGF分泌量。4、配制4種不同條件培養(yǎng)基：含10％DMEM的無血清內皮細胞培養(yǎng)基、10％單層成纖維細胞培養(yǎng)液的無血清內皮細胞培養(yǎng)基、10％復方殼多糖組織工程真皮培養(yǎng)液的無血清內皮細胞培養(yǎng)基和20％復方殼多糖組織工程真皮培養(yǎng)液的無血清內皮細胞培養(yǎng)基，[3H]-TdR摻入法測量其促進臍靜脈內皮細胞增殖的能力。 結果：1、組織工程真皮抗張強度隨成纖

4、維細胞數量增多而增強(p＜0.01)，復方殼多糖組織工程真皮的抗張強度高于膠原凝膠真皮(p＜0.01)。2、臍靜脈內灌注膠原酶法可獲取高純度的內皮細胞，與未凍存細胞相比，復蘇的細胞活力保持在80％以上，復蘇后生長曲線與未凍存細胞相似。3、成纖維細胞(FB)在三維培養(yǎng)時分泌的VEGF明顯高于其單層培養(yǎng)時的分泌量，復方殼多糖組織工程皮膚VEGF的分泌量又高于膠原凝膠組織工程皮膚。大多數培養(yǎng)液中VEGF含量在48小時內增長最快。4、復方殼多糖

5、組織工程真皮條件培養(yǎng)基促進臍靜脈內皮細胞的增殖作用高于對照組和單層成纖維細胞條件培養(yǎng)基，且其促進作用呈劑量依賴性。 結論：組織工程真皮抗張強度與成纖維細胞數量成正比，殼多糖、透明質酸和6-硫酸軟骨素等能顯著提高組織工程真皮的抗張強度。復方殼多糖真皮替代物具有良好的抗張強度，為臨床應用提供穩(wěn)定機械性能。臍靜脈灌注酶消化法可獲取大量高純度的內皮細胞。凍存的內皮細胞復蘇后仍保持較高的體外增殖能力，可作為制備含血管的組織工程皮膚的種子細