內質網應激相關因子對不同心臟手術心肌保護作用的對比研究.pdf

1、目的:在心臟外科的研究中，心肌保護一直是研究的熱點，心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是在術中導致心肌細胞損傷的最主要因素，也是主要的研究方向。MIRI是一個多因素的病理生理過程，目前已知的通路主要有鈣離子超載、線粒體途徑、微血管創(chuàng)傷、炎癥反應以及脂類物質超氧化等機制，在此研究之上，近年來發(fā)現內質網應激(ERS)可以影響細胞凋亡及組織的炎癥反應并且在MIRI中發(fā)揮重要作用。在ERS中內質網通過激活未折疊蛋白反應(UPR)以保護由ERS所引起

2、的細胞損傷，恢復細胞功能。葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)可以促進內質網內蛋白折疊、恢復內質網的功能，起到保護細胞的作用，同時也是內質網應激啟動的信號，與介導凋亡途徑的跨膜蛋白結合，使其處于失活狀態(tài)。Caspase-12位于內質網胞漿面，該物質是內質網應激介導凋亡的一種特異性介質，僅僅存在于內質網應激中，并介通過激活Caspase-3介導凋亡。核因子-kB(NF-kB)是一個多向性核轉錄調節(jié)因子，在多種急性應激反應中表達，目前被認為是內

3、質網應激介導的炎癥反應的關鍵因子，關于其的損傷心肌作用和心肌保護作用均有報道，上述三種蛋白及調控因子具體作用機制復雜且先前的研究多在細胞層面進行，關于動物實驗亦或人體中的實驗目前尚待進一步研究。對于減少術中心肌損傷，體外循環(huán)下心臟不停跳手術有獨到的優(yōu)勢，其術式在90年代末開始開展應用，并逐漸發(fā)展，已有了長足的進步，關于該術式的研究也充分證明了其有良好的預防MIRI作用，可以有效的進行腦、肺、腎臟等多臟器的保護。但關于其分子層面的研究目前

4、尚少。本實驗建立體外循環(huán)的模型，探索心臟停跳及不停跳手術的情況下，ERS的反應強度及細胞凋亡程度，探索ERS以及其中的三種調節(jié)因子在不同手術方式下的表達情況，并對比手術的優(yōu)缺點。
　　方法:動物由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，為成年新西蘭大白兔共36只，將實驗動物隨機分為停跳組(體外循環(huán)心臟停跳組，n=12)，不停跳組(體外循環(huán)心臟不停跳組，n=12)以及對照組（假手術組）。建立兔體外循環(huán)模型。假手術組僅作開關胸手術，不做其他處理

5、。不停跳組體外通過頸總動脈作為動脈灌注，頸總靜脈作為靜脈引流，進而建立循環(huán)，維持體外循環(huán)約120min，整個實驗過程中不進行停跳液的灌注、不阻斷升主動脈及上下腔靜脈、冠狀動脈維持血流灌注。停跳組建立體外循環(huán)后，并行循環(huán)約15min，將實驗動物溫度降低至28℃～30℃時將主動脈阻斷，并從主動脈根部灌注St.ThomasⅡ停搏液（15ml/kg，約4℃），總共灌注3次St.ThomasⅡ停搏液（后兩次分別于30min和60min分別進行，灌

6、注量為第一次的一半）。灌注完畢后緩慢復溫，于實驗動物處于34℃時基本恢復全流量，最后使心臟復跳并行體外循環(huán)。實驗動物生命體征平穩(wěn)后停止體外循環(huán)操作。實驗成功的標志為實驗動物在停止體外循環(huán)1個小時后仍存活，處死實驗動物，進行心肌標本的采集。根據免疫組化試劑盒的步驟分別對三組實驗動物心肌進行GRP78、Caspase-12以及NF-kB的表達檢測，并對三組動物的心肌行TUNEL法檢測凋亡率。
　　結果:(1)GRP78的表達量:停跳組

7、(72.24％±7.89％)，不停跳組(16.53％±2.59％)，假手術組(1.68％±1.19％)，組間差別有明顯統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　(2)NF-kB的表達量:停跳組(73.70％±6.70％)，不停跳組(13.81％±1.79％)，假手術組(2.42％±1.42％)，組間差別有明顯統(tǒng)計學意義(P＜0.01)
　　(3)Caspase-12的表達量:停跳組(73.74％±7.15％)，不停跳組(14.49％

8、±2.29％)，假手術組(2.46％±1.56％)，組間差別有明顯統(tǒng)計學意義(P＜0.01)
　　(4)心肌細胞凋亡指數(AI):心臟停跳組凋亡率為(10.11±0.53)，心臟不停跳組(4.27±0.61)，對照組為(1.33±0.35)(P＜0.01)。組間差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)
　　(5)相關性分析:心臟停跳組以及心臟不停跳組心肌細胞凋亡率與該組caspase-12表達量相關系數分別為為0.961(P＜0.0

9、1)以及0.912(P＜0.01)，呈明顯的正相關;與該組GRP78表達量相關系數分別為0.827(P＜0.01)以及0.831(P＜0.01)，呈正相關，與該組NF-kB表達量相關系數分別為0.317(P＞0.05)以及0.281(P＞0.05)，無明顯相關性;
　　結論:(1)GRP78在心臟停跳及不停跳組中都明顯升高，說明內質網應激參與了體外循環(huán)中細胞的損傷。
　　(2)Caspase-12在兩個實驗組中明顯升高說明了