貴州綠僵菌產(chǎn)殼聚糖酶的純化鑒定及高產(chǎn)菌株的誘變選育.pdf

1、甲殼素是地球上數(shù)量最大的含氮有機(jī)化合物，據(jù)估計(jì)自然界每年生物合成的甲殼素近100億噸。殼聚糖是甲殼素的脫乙?；漠a(chǎn)物。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)殼聚糖的低聚糖(殼寡糖)有重要的生物活性，尤其是六糖和七糖在抑制腫瘤方面的作用令人鼓舞。用專(zhuān)一性的殼聚糖酶(Chitosanase)水解膠體殼聚糖，控制反應(yīng)條件，可獲得含五糖和六糖較高的低聚糖。目前國(guó)內(nèi)外真菌源殼聚糖酶的報(bào)道主要集中在曲霉屬、青霉屬和球孢白僵菌等，其純化方法也多采用鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、離子交換層

2、析等方法。尋找殼聚糖酶新酶源、簡(jiǎn)化殼聚糖酶的純化工藝、利用理化因子誘變選育高產(chǎn)殼聚糖酶菌株極具研究?jī)r(jià)值。 本研究在本實(shí)驗(yàn)室前期篩選到產(chǎn)殼聚糖酶活性較高的貴州綠僵菌AS3.4608，并對(duì)其進(jìn)行低成本的固態(tài)發(fā)酵的基礎(chǔ)上，對(duì)貴州綠僵菌AS 3.4608固態(tài)發(fā)酵物提取液采用兩步層析進(jìn)行分離純化，即采用自制交聯(lián)殼聚糖樹(shù)脂親和吸附殼聚糖酶后用Cu<'2+>洗脫，再以Superdex 75層析分離，經(jīng)SDS-PAGE證實(shí)獲得了電泳純的殼聚糖

3、酶，比活達(dá)106.39U/mg，每克干培養(yǎng)基可獲殼聚糖酶328ug，活性回收率為43.25％，酶蛋白分子量為50.3KD。對(duì)樣品理化性質(zhì)研究表明，該酶在45℃以下有較好的穩(wěn)定性，在弱酸性(pH 5.0-7.0)的溶液中也相當(dāng)穩(wěn)定。該殼聚糖酶降解殼聚糖反應(yīng)最適溫度為50℃，最適pH為4.0。其米氏常數(shù)K<,m>值為2.718g/L，V<,max>為1.152×10<'-2>g·L<'-1>·min<'-1>。Hg<'2+>對(duì)該酶有強(qiáng)烈抑制

4、作用，Mn<'2+>、Mg<'2+>、Zn<'2+>、Fe<'3+>、Ag<'+>對(duì)其有較強(qiáng)抑制作用，Cu<'2+>對(duì)其有較強(qiáng)激活作用。該酶是一種糖蛋白，含糖量約為26.33％。該酶最適底物為脫乙酰度為90％的膠體殼聚糖。本研究采用紫外線和氯化鋰對(duì)貴州綠僵菌AS 3.4608進(jìn)行復(fù)合誘變，篩選到了一株遺傳穩(wěn)定、產(chǎn)酶活力高的菌株Y0320。并對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化研究，經(jīng)L9(33)正交實(shí)驗(yàn)，最終確定其最佳發(fā)酵條件為：以黃豆粉：麩皮=2