丹參酮IIA磺酸鈉通過PKG-PPARγ-TRPC信號通路抑制缺氧誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細(xì)胞SOCE的上調(diào).pdf

1、【研究背景】肺動脈高壓（PAH）是一類以海平面靜息狀態(tài)下，肺動脈平均壓（mPAP）≥25mmHg（右心導(dǎo)管下）為血流動力學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)的疾病。它是一種可伴隨多種臨床癥狀并能導(dǎo)致嚴(yán)重心肺功能障礙，最終致患者死亡的臨床綜合征，其主要臨床病理生理特點為肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）異常增殖、血管重構(gòu)導(dǎo)致肺動脈壓持續(xù)性、漸進(jìn)性增高。近年來靶向藥物的出現(xiàn)及其廣泛使用給廣大肺動脈高壓患者帶來了福音，然而價格的高昂及較多副作用大大地限制其治療。因此，尋

2、找肺動脈高壓新靶點及新型藥物顯得尤為重要。我們和其他課題組以往的研究發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA磺酸鈉（STS）可通過抑制經(jīng)典瞬時受體蛋白1，6（TRPC）的表達(dá)從而調(diào)節(jié)PASMCs中的鈣穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而有效降低慢性低氧性肺動脈高壓（CHPH）大鼠模型及野百合堿（MCT）致肺動脈高壓大鼠模型的mPAP及其血管重塑。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)了STS可有效治療肺動脈高壓患者。然而， STS通過何種途徑對PASMCs中基礎(chǔ)鈣(basal[Ca2+]i)及鈣池操縱性

3、鈣內(nèi)流（SOCE）進(jìn)行調(diào)控仍需要進(jìn)一步研究。已有文獻(xiàn)證實蛋白激酶G（PKG）/過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)通路參與調(diào)節(jié)PASMCs中TRPC1，6蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響basal[Ca2+]i和SOCE，并最終導(dǎo)致PASMCs的過度增殖，肺血管重塑。在此基礎(chǔ)上，提出了研究假設(shè)：STS通過PKG/PPARγ/TRPC信號通路，從而對PASMCs中的鈣穩(wěn)態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)。
　　【研究目的】本研究運用CHPH大鼠動物模型驗證STS

4、對肺動脈高壓的治療作用；運用大鼠遠(yuǎn)端 PASMCs原代培養(yǎng)模型及 CHPH大鼠動物模型觀察 STS干預(yù)對PASMCs及肺動脈平滑肌組織（PA）中PKG、PPARγ蛋白表達(dá)的影響；運用PKG抑制劑（RP-8）及PPARγ抑制劑(T0070907),觀察STS對PASMCs中TRPC1、TRPC6蛋白表達(dá)、[Ca2+]i及SOCE的影響；構(gòu)建PKG及PPARγ特異性小分子干擾RNA（siRNA）沉默PKG及PPARγ表達(dá)，觀察 STS對 P

5、ASMCs中 TRPC1、TRPC6蛋白表達(dá)、[Ca2+]i及SOCE的影響；通過 MTT實驗，觀察 PKG抑制劑（RP-8）及 PPARγ激動劑(GW1929)、抑制劑(T0070907)是否影響STS在缺氧狀態(tài)下對PASMCs增殖的抑制。從而探討 STS參與 PASMCs中鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的機(jī)制是否通過PKG/PPARγ/TRPC信號通路，為STS防治肺動脈高壓疾病提供堅實的理論基礎(chǔ)并尋找更有效靶點。
　　【研究方法】
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6、.建立慢性低氧性肺動脈高壓大鼠模型：（1）運用小動物生理儀檢測STS刺激對右心室收縮壓（RVSP）、平均右心室壓（mRVP）和右心肥厚指數(shù)（RV/(LV+S)）的作用；（2）利用蘇木精和伊紅（HE）染色觀察STS刺激對肺血管重塑的影響；（3）利用Western blotting技術(shù)測定STS刺激對PA中PKG、PPARγ蛋白表達(dá)產(chǎn)生的影響。
　　2.建立原代肺動脈平滑肌細(xì)胞模型：（1）利用InCyte細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng)，檢測ST

7、S及RP-8或GW1929或T0070907聯(lián)合刺激對大鼠PASMCs的基礎(chǔ)[Ca2+]i和SOCE的影響；（2）應(yīng)用Western blotting檢測STS刺激對大鼠遠(yuǎn)端PASMCs中PKG、PPARγ蛋白表達(dá)產(chǎn)生的影響，在此基礎(chǔ)上觀察STS及RP-8或GW1929或T0070907聯(lián)合刺激對大鼠遠(yuǎn)端PASMCs中 TRPC1、TRPC6蛋白表達(dá)的影響；（3）構(gòu)建并轉(zhuǎn)染特異性的siR-PKG及siR-PPARγ到PASMCs,利用I

8、nCyte細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng)檢測STS刺激對大鼠PASMCs的基礎(chǔ)[Ca2+]i和SOCE的影響并運用Western blotting檢測STS刺激對大鼠遠(yuǎn)端PASMCs中TRPC1、TRPC6蛋白表達(dá)產(chǎn)生的影響；（4）利用MTT實驗,觀察STS及RP-8或GW1929或T0070907聯(lián)合刺激對大鼠遠(yuǎn)端PASMCs增殖的影響。
　　【實驗結(jié)果】
　　1、腹腔注射 STS（30mg/kg.d）治療可降低慢性低氧性肺動脈高壓

9、大鼠模型中的RVSP、mRVP和RV/(LV+S)，逆轉(zhuǎn)模型組大鼠的血管重塑。
　　2、STS（30mg/kg.d）干預(yù)治療可上調(diào)CHPH大鼠肺動脈平滑肌組織PKG及PPARγ蛋白表達(dá)，且STS（12.5μM,60h）刺激可升高原代培養(yǎng)的大鼠遠(yuǎn)端PASMCs中PKG及PPARγ蛋白表達(dá)。
　　3、缺氧狀態(tài)下，PKG抑制劑RP-8(1μM,60h)刺激可逆轉(zhuǎn)STS對大鼠遠(yuǎn)端PASMCs中PPARγ蛋白的上調(diào)及對TRPC1、TR

10、PC6蛋白的下調(diào)效應(yīng)；而PPARγ拮抗劑T0070907(10μM,60h)刺激可抑制STS對大鼠遠(yuǎn)端PASMCs中TRPC1、TRPC6蛋白的下調(diào)作用。
　　4、缺氧狀態(tài)下，特異性 PKG siRNA可抑制 STS對大鼠遠(yuǎn)端 PASMCs中PPARγ蛋白的上調(diào)及TRPC1、TRPC6蛋白的下調(diào)作用；而siR-PPARγ則可逆轉(zhuǎn)STS對的大鼠遠(yuǎn)端PASMCs中TRPC1、TRPC6蛋白表達(dá)的下調(diào)作用。
　　5、PKG抑制劑R

11、P-8(1μM,60h)或PPARγ拮抗劑T0070907(10μM,60h)刺激可以抑制缺氧狀態(tài)下STS對的基礎(chǔ)鈣和SOCE的下調(diào)效應(yīng)；相反，PPARγ的激動劑GW1929(10μM,60h)則可促進(jìn)STS對基礎(chǔ)鈣和SOCE的下調(diào)效應(yīng)。
　　6、缺氧狀態(tài)下，PKG抑制劑RP-8(1μM,60h)或PPARγ拮抗劑T0070907(10μM,60h)均可抑制STS對大鼠遠(yuǎn)端PASMCs細(xì)胞增殖的抑制作用，而PPARγ的激動劑GW1