HLA-G1、-G5異構(gòu)體抑制NK細(xì)胞毒性的累加效應(yīng)研究.pdf

1、目的:
　　本研究通過基因克隆建立穩(wěn)定表達(dá)HLA-G1或HLA-G5異構(gòu)體的K562細(xì)胞株，以及通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞膜表面CD107a分子的表達(dá)水平，旨在探討腫瘤細(xì)胞不同程度表達(dá)HLA-G1或分泌HLA-G5抗原對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的影響。
　　方法:
　　1.HLA-G1或HLA-G5真核表達(dá)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及鑒定將HLA-G1或HLA-G5全長(zhǎng)基因連接到真核表達(dá)載體pVITR02 mcs上，經(jīng)限制內(nèi)切酶雙酶切及測(cè)

2、序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建正確性。將測(cè)序正確的HLA-G1/pVITR02-mcs和HLA G5/pVITR02-mcs及陰性對(duì)照pVITR02-mcs轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞株中，用潮霉素進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)HLA-G1/HLA-G5K562細(xì)胞株，并用流式細(xì)胞術(shù)(MEM-G/09抗體)、western blot(4H84抗體)進(jìn)行鑒定。
　　2.靶細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)K562-HLA-G1和K562細(xì)胞按不同比例混合培養(yǎng)獲得不同表達(dá)量mHLA-G1-

3、K562細(xì)胞群;K562 HLA-G5細(xì)胞培養(yǎng)上清用倍比稀釋法獲得不同表達(dá)濃度的sHLA-G5;將NK-92MI細(xì)胞分別與兩種K562細(xì)胞群以5∶1的比例混合培養(yǎng)，1小時(shí)后加入莫能菌素;再過3h后加入CD107a和CD56抗體，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CD56+NK細(xì)胞群CD107a的表達(dá)率。
　　3.NK細(xì)胞表面受體和抗體阻斷實(shí)驗(yàn)分別采用單克隆抗體ILT2-PE、ILT4-FITC、KIR2DL4-PE檢測(cè)NK-92MI細(xì)胞株表面的IL

4、T2、ILT4、KIR2DL4受體的表達(dá)。將靶細(xì)胞K562-HLA-G細(xì)胞群與87G抗體共孵育30min，加入效應(yīng)細(xì)胞NK-92MI，效靶比為5∶1，一式三份，重復(fù)三次，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD56+NK細(xì)胞群CD107a的表達(dá)率。
　　結(jié)果:
　　1.HLA-G1或HLA-G5真核表達(dá)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及鑒定經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切及測(cè)序證實(shí)HLA-G1/pVITR02-mcs和HLA-G5/pVTR02-mcs構(gòu)建成功，經(jīng)weste

5、rn blot、ELISA及流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)HLA-G轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞株成功。
　　2.靶細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)將不同表達(dá)量mHLA-G1-K562細(xì)胞群和不同表達(dá)濃度的sHLA-G5培養(yǎng)上清分別與NK-92MI細(xì)胞以效靶比5∶1的比例混合培養(yǎng)，檢測(cè)HLA-G1、HLA-G5抗原對(duì)NK殺傷活性的影響，結(jié)果顯示，HLA-G異構(gòu)體依賴其表達(dá)量高低發(fā)揮免疫抑制功能;與膜結(jié)合型HLA-G1相比，可溶性HLA-G5具有更強(qiáng)的抑制NK細(xì)胞殺傷活性的能力(

6、P＜0.05)。進(jìn)一步研究指出，不同程度表達(dá)的HLA-G1或HLA-G5抗原均能顯著抑制NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，并且兩者具有累加效應(yīng)。
　　3.NK細(xì)胞受體表達(dá)及HLA-G抗體阻斷實(shí)驗(yàn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK-92MI細(xì)胞株表面的ILT2、ILT4、KIR2DL4受體的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明:NK-92MI細(xì)胞表面ILT2受體表達(dá)率99.87％，KIR2DL4呈膜表面弱表達(dá)，而ILT4未檢測(cè)到;將靶細(xì)胞K562-HLA-G細(xì)胞群與8

7、7G抗體共孵育30min，加入效應(yīng)細(xì)胞NK-92MI，效靶比為5∶1，一式三份，重復(fù)三次，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD56+NK細(xì)胞群CD107a的表達(dá)率。結(jié)果顯示:當(dāng)K562-HLA-G1靶細(xì)胞表面的HLA-G1抗原被87G抗體封閉后，NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解百分比顯著增加(p＜0.01，)，但其活性末完全恢復(fù)(p=0.03)。
　　結(jié)論:
　　HLA-G異構(gòu)體依賴其表達(dá)量高低發(fā)揮免疫抑制功能;與膜結(jié)合型HLA G1相比，可溶性HL