白英生物堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌的抑制作用及凝集脂筏膽固醇抑制血管新生的抗腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、癌癥嚴(yán)重危害人類生命健康，尤其是目前高居我國(guó)惡性腫瘤死因榜首的肺癌，其發(fā)病率仍在逐年不斷提高。以非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)最為普遍，占肺癌總數(shù)80％～85％。并且約70％患者在確診時(shí)已屬中晚期，使得肺癌治療變得更加困難。目前對(duì)于放化療等的研究雖然日益深入，但針對(duì)NSCLC的治療效果仍不容樂(lè)觀，同時(shí)較強(qiáng)的毒副作用及抗藥耐藥性，給患者帶來(lái)不小的痛苦。近幾年來(lái)，隨著腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究

2、不斷深入，以血管新生作為靶點(diǎn)探索抗腫瘤的途徑及相關(guān)藥物的研發(fā)也已成為治療NSCLC的研究熱點(diǎn)，腫瘤/腫瘤血管新生發(fā)生發(fā)展過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵連接點(diǎn)VEGF/VEGFR2就是其中一個(gè)重要的靶向治療分子靶點(diǎn)。然而抑制腫瘤血管新生治療因?qū)EGF及其受體或者血管新生通路中其他調(diào)控因子直接作為靶點(diǎn)而致使的突變等也已顯示出一定的耐藥性，研究人員正試圖以多個(gè)靶點(diǎn)或者其他途徑解決這個(gè)臨床面臨的難題。
　　腫瘤與腫瘤血管是相互依存關(guān)系，腫瘤細(xì)胞以及腫瘤

3、血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜構(gòu)建都離不開(kāi)膽固醇的參與。經(jīng)大量相關(guān)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，糖苷生物堿具有結(jié)合膽固醇（包括細(xì)胞膜脂筏膽固醇）形成不溶性復(fù)合物的特性，將其與調(diào)控膽固醇流出破壞細(xì)胞膜脂筏結(jié)構(gòu)阻礙VEGF/VEGFR2結(jié)合從而抑制血管新生的最新研究進(jìn)展結(jié)合，以及腫瘤血管新生學(xué)說(shuō)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，設(shè)想通過(guò)結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜膽固醇破壞細(xì)胞膜脂筏結(jié)構(gòu)是否可達(dá)到抑制血管新生的作用，從而切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供給，使其無(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng)并萎縮，繼而達(dá)到抑瘤的效果。即

4、提出“糖苷生物堿直接凝集脂筏膽固醇抑制血管新生的抗腫瘤機(jī)制”假說(shuō)。
　　中藥白英(Solanum lyratum)系茄科(Solanaceae)植物白英的干燥全草，最早見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并被列為上品，已有兩千多年的應(yīng)用歷史。作為抗癌藥物可用于包括肺癌、食道癌、子宮頸癌、毛細(xì)血管瘤等多種腫瘤的治療。前期研究中證明了生物堿為白英抗腫瘤的活性成分，現(xiàn)從白英干燥全草中提取總生物堿，并通過(guò)傳統(tǒng)柱色譜及液質(zhì)聯(lián)用色譜分離得到四種糖苷生物堿單體

5、，考察白英總堿的急性毒性及對(duì)三種非小細(xì)胞肺癌的抑制作用。最后，基于血管新生探討白英生物堿通過(guò)凝集脂筏膽固醇抑制血管新生的抗腫瘤作用機(jī)制。
　　主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.首先以70％乙醇回流提取白英干燥全草，并經(jīng)過(guò)D151離子交換大孔吸附樹(shù)脂富集，AB-8大孔樹(shù)脂脫鹽，得到白英總堿（記為STA）。然后借助柱色譜以乙酸乙酯-95％乙醇(2.5∶1)為洗脫劑初步分離所提取出的白英總堿，得到A、B兩部分。再以液質(zhì)聯(lián)用色譜純化，從A

6、部分分離得到SA1和SA2，B部分分離得到SA3和SA4。借助核磁共振技術(shù)（包括一維1H-NMR和13C-NMR，以及二維1H-1H COSY、HMQC、HMBC、TOCSY和NOESY），分析鑒定四個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，分別為:(3β，22α，25R)-spirosolan-5-en-3-yl O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranosid

7、e(SA1)、(3β，5α,22α,25R)-spirosolan-3-yl O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(SA2)、(3β，22α,25R)-spirosol-5-en-3-yl O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-[β-D-xylopyranosyl-(1→3)]-O-β-D-glucopy

8、ranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(SA3)、(3β,5α,22α,25R)-spirosolan-3-yl O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-[β-D-xylopyranosyl-(1→3)]-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(SA4),四個(gè)化合物均為以螺旋甾堿烷為苷元母核的甾體糖苷生物堿。經(jīng)Science Fi

9、nder檢索結(jié)果表明，其中SA1、SA2、SA3為新化合物。以白英生物堿SA2作為對(duì)照品，采用酸性染料比色法進(jìn)行總堿含量測(cè)定，經(jīng)過(guò)方法學(xué)考察選出精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性等均良好，且回收率高的總堿含量測(cè)定方法，經(jīng)該方法檢測(cè)三批白英總堿樣品的總堿含量均在90％以上。
　　2.以小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)考察白英總堿的口服毒性作用;Lewis肺癌移植瘤小鼠模型研究白英總堿對(duì)其生存期的影響;以三種不同細(xì)胞亞型的非小細(xì)胞肺癌構(gòu)建裸鼠異種移植瘤模型考察白

10、英總堿的體內(nèi)抗腫瘤效果;并對(duì)A549移植瘤裸鼠的瘤組織進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色觀察其病理學(xué)變化，以CD31標(biāo)記的免疫組化法觀察瘤組織內(nèi)微血管密度(MVD)，免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)瘤組織周期蛋白CyclinA和CyclinB1表達(dá)水平，最后以TUNEL法檢測(cè)移植瘤的細(xì)胞凋亡情況。小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)白英總堿給藥劑量在10000 mg/kg.BW時(shí)未見(jiàn)動(dòng)物死亡，最大耐受量實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物未見(jiàn)異常，以該劑量為白英總堿的口服安全劑量，因安全劑量范圍

11、大，可在某種程度上認(rèn)為白英總堿基本無(wú)毒性作用。Lewis肺癌移植瘤小鼠的生存期實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示白英總堿可以有效地延長(zhǎng)生存時(shí)間(與模型組比,P＜0.05)，特別是白英總堿高劑量組的生命延長(zhǎng)率與陽(yáng)性對(duì)照紫杉醇組相當(dāng)(P＞0.05)，而最先死亡的動(dòng)物存活天數(shù)較紫杉醇組更長(zhǎng)。裸鼠異種移植瘤抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白英總堿對(duì)三種不同細(xì)胞亞型人非小細(xì)胞肺癌的裸鼠異種移植瘤均呈現(xiàn)劑量依賴性的抑制作用，腫瘤體積和重量均有明顯減少，并且體重均呈現(xiàn)逐步增加的趨勢(shì)，而

12、陽(yáng)性對(duì)照紫杉醇組的動(dòng)物體重增長(zhǎng)相比較緩慢，展現(xiàn)了白英總堿抑瘤的同時(shí)毒副作用小的優(yōu)勢(shì)。HE染色A549移植瘤組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，肉眼觀察，與模型組相比，給藥組細(xì)胞生長(zhǎng)活躍性降低，組織壞死面積擴(kuò)大，特別是白英總堿高劑量組可見(jiàn)明顯壞死;血管依白英總堿給藥劑量增加而減少，高劑量組幾乎觀察不到血管;纖維組織增生情況在給藥后也有明顯減弱。以CD31染色瘤組織進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)觀察腫瘤微血管密度MVD發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，隨著白英總堿濃度的增加，

13、腫瘤組織總血管數(shù)逐漸減少。免疫組化結(jié)果顯示白英總堿的抑制作用也體現(xiàn)在CyclinA和CyclinB1的蛋白表達(dá)(與模型組比，P＜0.05)，表明白英總堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌紊亂的細(xì)胞周期的調(diào)控作用，最后白英總堿升高腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)亦再一次驗(yàn)證白英總堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌的抑制作用。
　　3.通過(guò)Transwell小室同時(shí)培養(yǎng)HUVECs與A549細(xì)胞構(gòu)建共培養(yǎng)體系制備腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞Td-ECs。以RT-PCR檢測(cè)Td-ECs中腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)

14、胞特異性抗原TEM1和TEM8的表達(dá)情況;以透射電鏡和掃描電鏡觀察Td-ECs超微結(jié)構(gòu);采用MTT法檢測(cè)Td-ECs增殖能力;細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)觀察Td-ECs遷移能力;Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察Td-ECs侵襲能力;以體外管腔形成、大鼠動(dòng)脈環(huán)出芽、雞胚尿囊膜及斑馬魚(yú)腸下血管新生等實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞、組織、整體水平多個(gè)角度考察白英生物堿的抗血管生成作用。結(jié)果顯示，通過(guò)Transwell小室成功構(gòu)建了共培養(yǎng)體

15、系，上室A549細(xì)胞與下室HUVECs之間的聚碳酸醋膜，使得腫瘤細(xì)胞分泌相關(guān)因子誘導(dǎo)HUVECs發(fā)展為腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞Td-ECs;經(jīng)RT-PCR檢測(cè)可擴(kuò)展出腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特有表達(dá)抗原TEM1和TEM8的條帶。經(jīng)共培養(yǎng)所得到的Td-ECs與HUVECs相比，超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了一系列的變化。透射電鏡下主要表現(xiàn)為線粒體形態(tài)的改變，Td-ECs細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多的囊泡結(jié)構(gòu)，線粒體空泡化明顯;掃描電鏡下Td-ECs細(xì)胞伸展度減小，可觀察到細(xì)胞末端絲狀

16、偽足變少，變短，這些改變使得Td-ECs更易于增殖、遷移。白英生物堿可劑量依賴性地抑制Td-ECs增殖，其中SA1的抑制作用最弱，在劑量100μM內(nèi)未能達(dá)到半抑制濃度(IC50); SA2、SA3、SA4、STA的半抑制濃度分別為81.334μM、75.265μM、2.950μM、49.548μg/mL。從四種糖苷生物堿的IC50及各自結(jié)構(gòu)式看出，糖鏈部分的不同和甾體母核5/6位的飽和程度可能影響糖苷生物堿對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。劃痕愈合

17、和Transwell小室實(shí)驗(yàn)從橫向和縱向證明白英生物堿可以抑制Td-ECs的遷移及侵襲能力;還可抑制Td-ECs管腔樣結(jié)構(gòu)的形成;此外，白英生物堿SA2劑量依賴性以及時(shí)間依賴性的抑制大鼠動(dòng)脈環(huán)切口處微血管樣結(jié)構(gòu)的芽生，濃度依賴性的抑制雞胚尿囊膜及斑馬魚(yú)胚胎腸下的血管生成。
　　4.通過(guò)試管法檢驗(yàn)白英生物堿SA2與膽固醇體外結(jié)合情況;以細(xì)胞外液LDH活性及PI染色判定Td-ECs細(xì)胞膜完整性和通透性;借助膽固醇試劑盒檢測(cè)Td-ECs

18、細(xì)胞內(nèi)外膽固醇含量，并且提取脂筏檢測(cè)脂筏區(qū)膽固醇含量，以熒光免疫雙標(biāo)記觀察膽固醇與脂筏共定位情況，同時(shí)以Westernblot法檢測(cè)ABCA1、ABCG1、AIBP蛋白表達(dá)水平考察膽固醇流出;借助透射電鏡觀察細(xì)胞膜小窩結(jié)構(gòu)及數(shù)量;ELISA法檢測(cè)Td-ECs細(xì)胞外液VEGF含量;Western blot法檢測(cè)VEGFR2、AKT、SRC、FAK、ERK磷酸化水平;熒光免疫雙標(biāo)記法觀察VEGFR2/CAV1及VEGFR2/EEA1共定位考

19、察VEGFR2的內(nèi)吞情況;最后以A549移植瘤斑馬魚(yú)評(píng)價(jià)白英生物堿SA2的抑瘤作用。結(jié)果顯示，白英生物堿SA2可直接與膽固醇結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的完整性，通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)LDH外漏。SA2作用Td-ECs后，細(xì)胞內(nèi)外膽固醇含量并未呈現(xiàn)良好的劑量和時(shí)間依賴性。經(jīng)低中劑量SA2處理，細(xì)胞總膽固醇含量先降低隨后升高，而在中高劑量SA2作用下，細(xì)胞總膽固醇水平又會(huì)從升高轉(zhuǎn)為降低趨勢(shì)，逐漸降至與對(duì)照組無(wú)顯著差異(與對(duì)照組比，P＞0.05);細(xì)胞

20、游離膽固醇水平整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，培養(yǎng)基游離膽固醇水平則呈現(xiàn)下降的趨勢(shì);膽固醇流出相關(guān)蛋白ABCA1、ABCG1、AIBP表達(dá)量呈現(xiàn)劑量依賴性降低;40μM的SA2的作用下，脂筏區(qū)的膽固醇含量顯著升高;經(jīng)過(guò)熒光免疫雙標(biāo)記顯示膽固醇與脂筏存在共定位，指示膽固醇的熒光強(qiáng)弱與試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量結(jié)果基本一致。以上結(jié)果考慮SA2凝集脂筏膽固醇，激發(fā)細(xì)胞自身膽固醇反饋調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成，致使細(xì)胞內(nèi)膽固醇集聚，然而由于糖苷生

21、物堿的束縛，膽固醇被包裹在細(xì)胞內(nèi)難以流出，隨著SA2濃度和作用時(shí)間的增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破碎。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)SA2作用后細(xì)胞膜小窩數(shù)量明顯減少，視野中很難找到小窩結(jié)構(gòu)。SA2劑量依賴性的抑制腫瘤細(xì)胞分泌VEGF，同樣劑量依賴性的阻礙VEGFR2、AKT、SRC、FAK、ERK的磷酸化水平。熒光免疫雙標(biāo)記結(jié)果顯示，VEGFR2與CAV1、VEGFR2與EEA1均存在共定位，隨著SA2的加入，Pearson相關(guān)系數(shù)降低，一定程度上阻礙VE

22、GFR2的內(nèi)吞，并且增加抑瘤基因CAV1的蛋白表達(dá)。最后人肺癌(A549)斑馬魚(yú)移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示SA2顯著的體內(nèi)抗腫瘤效果。
　　綜上所述，本研究借助柱色譜和液質(zhì)聯(lián)用色譜從白英中提取分離得到四種以螺旋甾堿烷為苷元母核的糖苷生物堿。以三種不同細(xì)胞亞型的非小細(xì)胞肺癌構(gòu)建裸鼠異種移植瘤模型證明了白英總堿的體內(nèi)抗腫瘤效果。從腫瘤血管內(nèi)皮Td-ECs增殖/遷移/侵襲及新生管腔、大鼠動(dòng)脈環(huán)的出芽、雞胚尿囊膜和斑馬魚(yú)的血管生成等多個(gè)角度展現(xiàn)白英生