利用插入序列ISS1構(gòu)建德氏乳桿菌保加利亞亞種突變體.pdf

1、分類號：Q2墨密級：公玨單位代碼：!QQ墨魚學(xué)號：2Q!!!!!利用插入序列ISSl構(gòu)建德氏乳桿菌保加利亞亞種突變體ConstructionofLactobacillusdelbrueckiisubspbulgaricusmutantsbyISSltransposoninsertion學(xué)位申請人：郭鑫指導(dǎo)教師：田洪濤教授學(xué)科專業(yè)：微生物學(xué)學(xué)位類別：理學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二零一四年六月一日摘要乳酸菌是一類能利用碳水化合物

2、產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的通稱，被公認(rèn)為是安全的食品級微生物。德氏乳桿菌保加利亞亞種作為其中的代表，已在醫(yī)藥保健、食品、飼料等行業(yè)中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)改進(jìn)保加利亞乳桿菌的生物學(xué)性狀，具有重要的市場應(yīng)用潛力。我們利用基因突變工具——質(zhì)粒pGhost9：ISSl去產(chǎn)生插入突變，并篩選目的突變體。帶有插入序翻JISSI的載體pGhost9：ISSl，復(fù)制受溫度控制，低溫28。C復(fù)制，高溫37“C以上不復(fù)制，可通過高溫度刺

3、激轉(zhuǎn)座的發(fā)生。該系統(tǒng)是復(fù)制型轉(zhuǎn)座，兩端復(fù)制有ISSl序列的載體插入到染色體上，能有效產(chǎn)生插入突變，突變頻率大于lO。2，并且這種插入是隨機(jī)的且無突變熱點(diǎn)，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條什下每個細(xì)胞只產(chǎn)生一個插入突變。而插入突變株在低溫刺激下，其染色體上的載體發(fā)生重組進(jìn)而從染色體上剔除，在消除載體的菌株染色體上將留下一個插入序列ISSj，從而剔除抗性基因產(chǎn)生穩(wěn)定的插入突變。本研究中利用兩端復(fù)制有ISSl的載體pGhost9：lSSl經(jīng)復(fù)制型轉(zhuǎn)座構(gòu)建德氏乳

4、桿菌保加利亞亞種突變體庫，并從中以2嵋mL。紅霉素、50嶺mLd脫氧胸苷、梯度濃度三甲氧芐胺嘧啶(TMP)連續(xù)富集傳代培養(yǎng)，并以添加終濃度50嶺mL’1脫氧胸苷的SA平板和不添加脫氧胸苷的sA平板篩選thyA基因缺陷型菌株。最終經(jīng)過33代富集培養(yǎng)TMP篩選壓力達(dá)500pgmL1時，篩選到了生物學(xué)性狀穩(wěn)定且回復(fù)突變率低的thyA基因突變株。為篩選弱后酸化突變菌株，通過構(gòu)建pGhostg：lSSl轉(zhuǎn)座突變體庫，在pH43條件下，突變細(xì)胞經(jīng)含

5、終濃度2000ggmL‘1青霉素處理5h，死亡率達(dá)506％，此時達(dá)到最佳富集效果，低pH條件下仍生長的細(xì)胞被殺死。處理后的菌液涂布在含終濃度2lagmL_Em的MRS平板上，長出的菌落分別點(diǎn)種pH43和pH65的MRS平板進(jìn)行篩選，得到12株低pH值條件下生長不良或不生長的菌株，經(jīng)進(jìn)一步檢驗，篩選出3株弱后酸化菌株，發(fā)酵性能與出發(fā)菌株相當(dāng)，但儲藏期時后酸化能力大為減弱。篩選到的弱后酸化菌株再通過低溫刺激，使轉(zhuǎn)座后的載體重組，載體部分從染