糖尿病大鼠頸性前庭誘發(fā)肌源性電位的觀察及其前庭外周傳入神經(jīng)系統(tǒng)與坐骨神經(jīng)的比較.pdf

1、目的：
　　第一部分通過建立糖尿病的大鼠模型，觀察糖尿病大鼠出現(xiàn)cVEMP閾值、P1潛伏期、N1潛伏期及P1-N1波間振幅出現(xiàn)異常的時(shí)間點(diǎn)，從而為進(jìn)一步研究其病理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第二部分通過建立糖尿病的大鼠模型，從造模成功后分成5個(gè)時(shí)間段來動態(tài)觀察前庭下神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)以及球囊斑病理形態(tài)學(xué)的改變，并將其與坐骨神經(jīng)出現(xiàn)損害的時(shí)間點(diǎn)相比較，以完善與豐富糖尿病對外周前庭器官損害的基礎(chǔ)研究，從而為指導(dǎo)臨床診治與預(yù)防提供

2、新的思路與方法。
　　方法：
　　1、動物分組及糖尿病模型的制備:雄性SD大鼠，體重300-350g（購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心），耳廓反應(yīng)靈敏、鼓膜標(biāo)志正常、無自發(fā)性眼震。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行糖尿病造模。
　　2、糖尿病大鼠模型制備:鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)使用前以0.1 mol/L、pH4.2-4.6的檸檬酸緩沖液配制成的1％STZ溶液，糖尿病組大鼠按照55mg/kg體重一次性腹腔注射S

3、TZ，對照組予腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。
　　3、ABR檢測:應(yīng)用Smart EP聽覺誘發(fā)電位儀（美國智聽系統(tǒng)公司）檢測大鼠ABR閾值。用2％戊巴比妥鈉以0.2ml/100g將大鼠麻醉后，將銀針電極的記錄電極置于顱頂正中皮下，參考電極置于同側(cè)乳突，接地電極置于后足部。刺激聲為疏密相交替的12.1次/s的短聲(click)，持續(xù)時(shí)間為0.1 ms，帶通濾波300～3000 Hz，觀察時(shí)程20 ms，疊加次數(shù)1024次。在距外耳道口1

4、.5 cm處通過插入式耳機(jī)給聲，刺激聲從100dB SPL開始，以10 dB遞減。以能分辨出ABR波型中Ⅲ波的最低刺激強(qiáng)度確定ABR閾值。
　　4、cVEMP檢測:應(yīng)用美國GSI公司Audera V2.7聽覺誘發(fā)電位儀檢測大鼠cVEMP結(jié)果。用2％戊巴比妥鈉以0.2ml/100g將大鼠麻醉，記錄時(shí)將大鼠頭部抬起，向前上方牽引，使頸部肌肉盡量處于過伸狀態(tài)。采用銀針插入電極，于雙側(cè)背部頸伸肌平C3頸椎棘突水平插入記錄電極，枕骨正中線插

5、入?yún)⒖茧姌O，后足部插入接地電極。插入式耳機(jī)固定于外耳道深部0.5cm處，刺激聲為click，交替波，刺激強(qiáng)度由100dB nHL開始，10dB nHL遞減，重復(fù)率為5.00 Hz，掃描204次，掃描時(shí)間40s，帶通濾波10Hz～1000Hz。記錄糖尿病不同時(shí)期cVEMP的反應(yīng)情況，記錄閾值、各波潛伏期及振幅值。每側(cè)耳均接受兩次cVEMP測試，各項(xiàng)指標(biāo)取其平均值。
　　5、形態(tài)學(xué)研究:選擇30只雄性SD大鼠，動物隨機(jī)分為對照組及糖尿

6、病組，再按照觀察時(shí)間將糖尿病組分為糖尿病4周組、糖尿病6周組、糖尿病8周組、糖尿病10周組及糖尿病12周組，用2％戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，剪開胸腔，暴露心臟，用生理鹽水及4％多聚甲醛溶液從左心室穿刺進(jìn)行灌注固定，迅速將大鼠斷頭，去除腦組織，暴露顱底，取出并打開聽泡，放置0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，在解剖顯微鏡下刺破圓窗膜，將鐙骨底板脫位暴露卵圓窗。在蝸頂鉆一小孔，用微量注射器緩慢注入4％多聚甲醛固定液至少5次，置于4％多聚甲醛固定液過

7、夜。
　　6、透射電鏡研究:選擇30只雄性SD大鼠，動物隨機(jī)分為對照組及糖尿病組，再按照觀察時(shí)間將糖尿病組分為糖尿病4周組、糖尿病6周組、糖尿病8周組、糖尿病10周組及糖尿病12周組，用2％戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，剪開胸腔，暴露心臟，用生理鹽水及2.5％戊二醛溶液從左心室穿刺進(jìn)行灌注固定，分別取出大鼠坐骨神經(jīng)及在解剖顯微鏡下取出前庭下神經(jīng)，放入戊二醛固定液中室溫下過夜。將標(biāo)本脫水、滲透與包埋、超薄切片、染色。在電鏡下觀察每組前庭下神

8、經(jīng)及坐骨神經(jīng)標(biāo)本有髓神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)如軸索、髓鞘、線粒體形態(tài)。
　　結(jié)果：
　　1、糖尿病組大鼠與對照組相比，糖尿病組大鼠出現(xiàn)多飲多食多尿，體重下降等典型糖尿病癥狀，精神萎靡，活動力下降，毛發(fā)發(fā)黃，后期有部分糖尿病大鼠出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變、壞疽、腹水等癥狀。各組糖尿病大鼠與對照組相比，血糖明顯升高(F=64.07，P＜0.01)，體重明顯下降(F=17.44，P＜0.01)，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明造模成功。
　　2、ABR對

9、照組與糖尿病不同時(shí)期組ABR的閾值(dB SPL)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=44.86，P＜0.01)，糖尿病第4周(35.50±2.84 dB SPL)的閾值與對照組(32.50±3.53 dB SPL)比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而糖尿病第6周(41.00±3.94 dB SPL)、第8周(46.50±5.80 dB SPL)、第10周(50.00±4.08dB SPL)、第12周(58.00±5.87 dB SPL)的閾值與對

10、照組比較具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　3、對照組與糖尿病不同時(shí)期組cVEMP的閾值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=27.65，P＜0.01)，對照組與各糖尿病組分別進(jìn)行方差分析，糖尿病第8周(53.87±11.16 dB nHL，P＜0.05)、第10周(67.00±12.74 dB nHL)、第12周(67.00±9.23 dB nHL)的閾值與對照組比較具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。對照組與糖尿病不同時(shí)期組的cVEMP的

11、N1潛伏期具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=18.21，P＜0.01)，各糖尿病組與對照組分別進(jìn)行方差分析，糖尿病第4周(7.90±0.73 ms)、第6周(7.98±0.75 ms)、第8周(7.77±0.54 ms)的N1潛伏期與對照組(7.79±0.55 ms)比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而糖尿病第10周(8.98±0.86 ms，P＜0.01)、第12周(9.08±0.45 ms，P＜0.01)的N1潛伏期與對照組比較具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)

12、差異。
　　4、糖尿病各組球囊斑HE染色結(jié)果顯示，與對照組比較球囊斑超微結(jié)構(gòu)，如前庭毛細(xì)胞的形態(tài)、支持細(xì)胞、毛細(xì)胞纖毛等均未發(fā)現(xiàn)明顯改變，無細(xì)胞萎縮、水腫、纖毛倒伏等病理改變。
　　5、電鏡結(jié)果顯示坐骨神經(jīng)較前庭下神經(jīng)更早出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的改變。在糖尿病成模后第4周坐骨神經(jīng)開始出現(xiàn)神經(jīng)形態(tài)學(xué)改變，并且隨著病程的延長，形態(tài)學(xué)改變更嚴(yán)重。前庭下神經(jīng)顯示，糖尿病第4周組、第6周有髓神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)與正常組并未出現(xiàn)明顯改變，有髓神經(jīng)纖維髓

13、鞘結(jié)構(gòu)清晰完整，軸索胞質(zhì)飽滿，線粒體結(jié)構(gòu)完整。從第8周開始出現(xiàn)了明顯結(jié)構(gòu)改變，并且視野內(nèi)病變的范圍較大，髓鞘出現(xiàn)斷裂、脫落，但軸索完整，未與髓鞘脫離，第10周出現(xiàn)節(jié)段性脫髓鞘，軸索萎縮，與髓鞘分離，第12周病變更嚴(yán)重范圍更廣，髓鞘崩解，軸索胞漿及雪旺氏細(xì)胞(SC)內(nèi)出現(xiàn)溶酶體。
　　結(jié)論：
　　1、研究結(jié)果表明糖尿病大鼠從第8周開始便可出現(xiàn)外周前庭終器及前庭傳導(dǎo)通路的的損傷，表現(xiàn)為明顯閾值提高、P1潛伏期的延長，在早期便可出

14、現(xiàn)外周前庭損傷，糖尿病的嚴(yán)重程度與病程時(shí)長都會對其前庭功能產(chǎn)生影響，cVEMP可作為早期診斷方法之一，為進(jìn)一步研究其病理機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)方法。通過對更長時(shí)間的動物模型和治療觀察等進(jìn)一步的研究，將有助于提高對糖尿病患者前庭功能障礙的診斷水平，對可引起平衡功能損傷的相關(guān)并發(fā)癥進(jìn)行早期干預(yù)，從而減少糖尿病患者因平衡功能障礙所致的摔倒、傷殘等嚴(yán)重后果，提高糖尿病患者的生活質(zhì)量。
　　2、在本研究中，糖尿病前庭下神經(jīng)較坐骨神經(jīng)

15、更遲出現(xiàn)有髓神經(jīng)纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)改變，糖尿病大鼠在第4周開始出現(xiàn)坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)改變，髓鞘斷裂、分離，并隨著病程的延長逐漸出現(xiàn)節(jié)段性脫髓鞘、軸索萎縮變性等結(jié)構(gòu)改變。而前庭下神經(jīng)從第8周才開始出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)改變，并且隨著病程的延長超微結(jié)構(gòu)破壞更嚴(yán)重。對進(jìn)一步研究其病理機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)方法，通過對更長時(shí)間的動物模型和治療觀察等進(jìn)一步的研究，并且可通過施加干預(yù)因素來觀察對出現(xiàn)坐骨神經(jīng)病變的大鼠前庭功能的改變，這些將有助于提高對糖尿病患

16、者前庭功能障礙預(yù)防與診斷水平，提高糖尿病患者的生活質(zhì)量。
　　3、本實(shí)驗(yàn)研究中，糖尿病大鼠雖然在第8周開始出現(xiàn)前庭下神經(jīng)的有髓神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)改變、損害，但各組的球囊的前庭毛細(xì)胞、支持細(xì)胞等結(jié)構(gòu)較正常對照組均未發(fā)現(xiàn)明顯異常，推斷可能球囊的前庭毛細(xì)胞、支持細(xì)胞的存活并不依賴于前庭下神經(jīng)結(jié)構(gòu)完整與功能正常。糖尿病第8周出現(xiàn)cVEMP的異?？赡芘c有髓神經(jīng)纖維受損有關(guān)，而球囊斑前庭毛細(xì)胞雖暫未發(fā)現(xiàn)明顯病變，但無法完全否定其對cVEMP異常的

17、影響，其機(jī)制尚需進(jìn)一步探討，推測在糖尿病早期前庭功能障礙中前庭神經(jīng)的損害可能起到更關(guān)鍵的作用。
　　綜上所述，糖尿病大鼠第4周開始出現(xiàn)坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)改變，第8周出現(xiàn)cVEMP異常及前庭下神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)改變，并隨著病程的延長損害更嚴(yán)重，但未發(fā)現(xiàn)明顯的球囊斑的形態(tài)學(xué)改變。糖尿病大鼠在早期便可出現(xiàn)外周前庭損傷，cVEMP可作為早期診斷方法之一，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)糖尿病前庭下神經(jīng)較坐骨神經(jīng)更遲出現(xiàn)有髓神經(jīng)纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)改變，對進(jìn)一步研究其病理機(jī)制提供

18、了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)方法。當(dāng)出現(xiàn)了周圍神經(jīng)系統(tǒng)癥狀而缺乏相應(yīng)的前庭功能癥狀時(shí)，應(yīng)盡早對患者進(jìn)行前庭系統(tǒng)功能的評估，以預(yù)防及減少對可引起平衡功能損傷的相關(guān)并發(fā)癥，從而減少糖尿病患者因平衡功能障礙所致的摔倒、傷殘等嚴(yán)重后果。后期可通過對更長時(shí)間的動物模型和治療觀察，并且可施加干預(yù)因素來觀察對出現(xiàn)坐骨神經(jīng)病變的大鼠前庭功能的改變，進(jìn)一步研究糖尿病對前庭功能障礙的機(jī)制，這些將有助于提高對糖尿病患者前庭功能障礙預(yù)防與診斷水平，提高糖尿病患者的生