光系統(tǒng)Ⅰ及其亞組分的分離純化與光破壞特性的研究.pdf

1、光系統(tǒng)Ⅰ(photosystemⅠ，PSⅠ)是光合膜上參與光合作用原初反應(yīng)過程的主要膜蛋白超分子復(fù)合體之一。高等植物的PSI是由核心復(fù)合體(14個(gè)亞基)和捕光色素蛋白復(fù)合體Ⅰ(light-harvesting complexⅠ, LHCI，含4個(gè)Lhca蛋白)組成的超分子復(fù)合體，它的主要功能是調(diào)節(jié)光誘導(dǎo)的從囊腔側(cè)的質(zhì)體蘭素(plastocyanin，PC)向基質(zhì)側(cè)的鐵氧還蛋白(ferredoxin，F(xiàn)d)的電子傳遞。研究PSI的結(jié)構(gòu)與功

2、能對(duì)于揭示植物光合作用高效吸能、傳能的分子機(jī)理具有重要意義。在本文中，我們首先建立了分離制備PSI及其亞組分的方法(Qin et al.，2007)，并在此基礎(chǔ)上對(duì)PSI在強(qiáng)光破壞的過程中結(jié)構(gòu)與功能的變化進(jìn)行了比較深入的研究。本論文的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.快速、高效分離純化PSI及其亞組分方法的建立。
　　 國(guó)際上傳統(tǒng)的PSI分離方法(Bassi and Simpson，1987；Croce et al.,199

3、8；P(a)sllon et al.1995；Schmid et al.2002)，耗時(shí)長(zhǎng)較長(zhǎng)(分離PSI顆粒一般需要多于20h的蔗糖超速離心過程，而分離PSI的亞組分則需要25-60h的蔗糖超速離心過程)、得率較低，這不便于PSI方面的研究，為此我們首先改進(jìn)了傳統(tǒng)的分離純化方法。新方法以高等植物菠菜葉片作為原材料，使用Triton X-100作為增溶劑，通過差速離心技術(shù)獲得的粗制品，然后使用十二烷基麥芽糖苷(n-Dodecylβ-D-

4、maltoside，DDM)增溶PSI粗制品，之后采用100,000×g，垂直轉(zhuǎn)頭(Beckman VTi50)0.1-1 mol/L蔗糖梯度離心3h獲得純度較高的PSI顆粒。然后使用DDM和3-(N，N-Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate(zw3-16)兩種增溶劑處理PSI，后經(jīng)100,000×g，垂直轉(zhuǎn)頭(Beckman VTi50)蔗糖梯度離心4h獲得純度較高的PSI core、LHC

5、I-680、LHCI-730復(fù)合體。采用吸收光譜、熒光光譜技術(shù)研究了各樣品的基本光譜學(xué)特性，采用HPLC分析了各樣品的色素組成，結(jié)果顯示平均每個(gè)Lhca蛋白結(jié)合1.5-1.6黃體素，1.0紫黃質(zhì)，0.8-1.1β-胡蘿卜素，該方法制備的LHCI比傳統(tǒng)方法制備的LHCI減少了類胡蘿卜素的丟失。這一工作為以后結(jié)構(gòu)與功能的研究工作奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 2.PSⅠ復(fù)合體及其亞組分的特性研究。
　　 PSⅠ顆粒具有一定的適應(yīng)環(huán)

6、境酸堿變化的能力，在我們的試驗(yàn)條件下PSⅠ顆粒在pH5-10相對(duì)穩(wěn)定。PSⅠ、LHCI很難通過加入Mg2+、Ca2+、Na+陽離子聚集沉淀。經(jīng)綠膠鑒定我們制備的LHCI-680、LHCI-730是二聚體形式；而把PSI綠膠后再進(jìn)行第二向十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在稍強(qiáng)烈的綠膠增溶條件下，LHCI-730是以二聚體的形式存在，但是LHCI-680卻是以單體的形式出現(xiàn)。這說明LHCI形成的二聚體，尤

7、其是LHCI-680，較容易受到增溶處理而分離成單體形式，解釋了以生化分離手段得到的LHCI-680的聚集形式是單體還是二聚體這個(gè)目前國(guó)際上還有有爭(zhēng)議的問題。
　　 3.PSⅠ、LHCI光破壞的基本特點(diǎn)。
　　 采用白光(2500μmol·m-2·s-1)照射PSI顆粒，通過SDS-PAGE及室溫吸收光譜檢測(cè)光照過程中PSⅠ復(fù)合體的變化，結(jié)果表明：去氧處理能夠大大延緩PSⅠ的光破壞，而PSⅠ脫輔基蛋白不會(huì)發(fā)生光破壞，這說

8、明PSⅠ發(fā)生的光破壞可能與Chl與O2的相互作用有關(guān)。采用白光(1000μmol·m-2·s-1、300μmol·m-2·s-1)處理LHCI-680、LHCI-730，發(fā)現(xiàn)LHCI-680被破壞的速度明顯快于LHCI-730被破壞的速度，這是首次在體外分離的水平上揭示了不同LHCI光破壞方面的差異。LHCI-680與LHCI-730在光破壞方面的差異可能與兩種天線蛋白結(jié)合的類胡蘿卜素的種類和數(shù)量不同有關(guān)，還可能與二者結(jié)合的長(zhǎng)波長(zhǎng)Chl

9、的情況有關(guān)，但是具體的原因還有待于進(jìn)一步的研究。
　　 4.結(jié)合不同的捕光色素蛋白復(fù)合體(light-harvesting complex，LHC)對(duì)PSⅠ光破壞的影響。
　　 為了研究結(jié)合不同的捕光天線對(duì)PSⅠ光破壞的影響，我們制備了PSⅠ-LHCⅡ、PSⅠ、PSⅠ core三種復(fù)合體。使用白光(2500μmol·m-2·s-1)照射這三種復(fù)合體，并通過測(cè)定各復(fù)合體在光破壞過程中蛋白亞基、吸收光譜、PSⅠ活性及P700

10、含量的變化，對(duì)比三者光破壞的速度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSⅠ-LHCⅡ在這三種復(fù)合體中光破壞速度最快，而PSⅠ和PSⅠ core兩種復(fù)合體光破壞速度基本一致。我們推測(cè)在光照過程中部分光系統(tǒng)Ⅱ捕光Chl a/b蛋白復(fù)合體Ⅱ(light-harvesting complexⅡ，LHCⅡ)能夠向PSⅠ core傳遞能量，另外PSⅠ-LHCⅡ綠膠分析的結(jié)果表明發(fā)生了LHCⅡ三聚體向單體的轉(zhuǎn)變，這種強(qiáng)光下發(fā)生的LHCⅡ聚合形式的轉(zhuǎn)化可能是高光強(qiáng)下調(diào)節(jié)光能捕獲