朗格漢斯細胞組織細胞增生癥中BRAF和MAP2K1基因突變分析及其臨床病理學研究.pdf

1、研究背景：
　　朗格漢斯細胞組織細胞增生癥（langerhans cell histiocytosis, LCH），以前又名組織細胞增生癥X，是以CD1a+/CD207+樹突狀細胞異常克隆增生的一類疾病1,2。LCH的發(fā)病率很低，大約1~5/100萬人，男女比例大約為2:13。起初臨床分為3類：勒-雪病(Letterer-Siwe disease)、韓-薛-柯病(Hand-Schuller-Christian disease)、嗜

2、酸性細胞肉芽腫（eosinophilic granuloma of bome）4；目前主要根據侵及器官和部位的數量分為2類：單系統(tǒng)性LCH（single systemlangerhanscell histiocytosis, SS-LCH）和多系統(tǒng)性LCH（multisystem systemlangerhanscell histiocytosis, MS-LCH），其中SS-LCH又可以分為單系統(tǒng)單病灶LCH和單系統(tǒng)多病灶LCH5。L

3、CH好發(fā)于小兒，臨床癥狀復雜多變，異質性強；輕則表現(xiàn)為皮膚、單骨或多骨損害伴或不伴有尿崩癥，重則表現(xiàn)為多個危險器官的侵及（如肝、脾、造血系統(tǒng)）。LCH的發(fā)病機制尚不明確，對于它的性質，一直存在炎癥和腫瘤的爭論。直到2010年Badalian-Very G等人發(fā)現(xiàn)在LCH中有重現(xiàn)性的BRAF V600E基因的突變6，才認定LCH為一種腫瘤性的疾病;隨后的一些研究發(fā)現(xiàn)，除BRAF以外，LCH中還存在其他的基因突變，比如：ARAF，MAP2K

4、1基因等7-9。有趣的是，這些突變的基因所編碼的蛋白都是RAS/RAF/MEK/ERK通路的組成成分，提示RAS/RAF/MEK/ERK通路在LCH的發(fā)病機制中可能起重要作用。
　　LCH細胞的來源至今都不明確。但可以肯定的是，它來源于未成熟髓系樹突狀細胞而不是表皮朗格漢斯細胞10。隨著樹突狀細胞的深入研究，我們需要重新審視LCH細胞的功能和表型，從而進一步揭示 LCH的發(fā)病機制。至今，國內外尚無RAS/RAF/MEK/ERK通路

5、和LCH細胞分化抗原相關性的研究報道。
　　雖然基因突變一直被認為是腫瘤發(fā)生的原因，但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境在其中也起著非常重要的作用11。由于疾病的罕見性以及異質性，關于 LCH腫瘤微環(huán)境對發(fā)病機制影響的認知較少。然而，免疫細胞包括調節(jié)性T細胞（Tregs）、輔助性T細胞以及巨噬細胞在LCH中表達升高12,13，提示腫瘤免疫微環(huán)境在LCH的發(fā)病過程中占有重要地位。最近的研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤中 BRAF突變會破壞機體的宿主

6、免疫從而促進腫瘤的免疫逃避。是否BRAF突變的LCH病人中也有類似的發(fā)病機制呢？目前尚無研究報道，是值得探討的科學問題。
　　實驗目的：
　　本實驗旨在研究LCH中BRAF和MAP2K1基因的突變與LCH細胞分化相關抗原的關系和對腫瘤免疫微環(huán)境的影響，并進一步分析它們的臨床意義，試圖闡明LCH的發(fā)病機制和給臨床治療提供新思路。
　　實驗方法：
　　隨機選取西京醫(yī)院病理科2006-2015年97例LCH病人標本。所

7、有標本均經10％福爾馬林固定，石蠟包埋，5μm連續(xù)組織切片，分別做常規(guī)HE染色和CD1a，CD207， VE1，CD14，CD83，CD86， pERK，T-bet，GATA3，F(xiàn)OXP3，PDL1等抗體的免疫組化染色（T-bet和GATA3進行雙染）。用QIAGEN試劑盒提取石蠟組織DNA，接著PCR，BRAF基因檢測的是外顯子15，MAP2K1基因檢測的是外顯子2和3；PCR產物跑電泳，純化，測序。采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)

8、計學分析，均值的比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料的比較采用卡方檢驗（chi-square test），相關性分析采用Pearson’s相關系數分析。用Kaplan–Meier生存曲線繪制總生存率（OS）和無病生存期（DFS），生存曲線的比較用log-rank檢驗，預后指標的評估及分析采用Cox比例風險模型和ROC曲線。p<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。用GraphPad Prism6.0和Adobe Photoshop對實驗圖片進行處理

9、分析。
　　實驗結果：
　　1.在97例LCH中，男女比例為1.8:1，77.6%侵及骨組織，91.8%是單系統(tǒng) LCH(single system LCH,SS-LCH)，8.2%是多系統(tǒng)LCH（multi-system LCH, MS-LCH）。Sanger測序法檢測BRAFV600E基因突變率為32%，MAP2K1基因突變率為17.5%，與BRAFV600E基因突變有互異性；所有MAP2K1突變都是錯義突變，沒有框內缺

10、失突變，我們還發(fā)現(xiàn)2個新的突變位點（p.E38K和 p.P105S）。免疫組化法檢測的BRAFV600E陽性表達率為37.1%，涵蓋了桑格測序法測得的突變病例；BRAFV600E和MAP2K1基因突變更多出現(xiàn)在未成年組(p<0.05)。
　　2. BRAF/MAP2K1-mut的LCH細胞表達CD14增多，很少表達CD83和CD86(p<0.001)；而BRAF/MAP2K1-wt的LCH細胞表達CD83和CD86增多，很少表達C

11、D14(p<0.001)。BRAFV600E和MAP2K1基因突變和pERK高表達密切相關(p<0.001)。
　　3. BRAFV600E突變和PDL1、FOXP3高表達密切相關(p<0.001，0.009)。此外，(GATA3)+/T-bet+比值可以區(qū)分MS/SS多病灶LCH和SS單病灶LCH。
　　4.經 Cox多因素生存分析，發(fā)現(xiàn) BRAFV600E和 PDL1是 LCH無病生存期（disease-free sur