CD82胞外小環(huán)結(jié)構(gòu)域抑制腫瘤細(xì)胞遷移及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)理的研究.pdf

1、CD82蛋白是抑癌基因KAI1編碼的細(xì)胞膜糖蛋白，屬于四跨膜蛋白超家族(transmembrane4 superfamily TM4SF)成員之一，其主要生物學(xué)功能是參與細(xì)胞的聚集、粘附、遷移以及調(diào)控。CD82在正常機(jī)體組織廣泛表達(dá)，在腫瘤組織表達(dá)下降或不表達(dá)。大量研究結(jié)果表明，CD82可抑制多種組織來源的腫瘤細(xì)胞體外遷移和體內(nèi)轉(zhuǎn)移，被認(rèn)為是廣譜的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子。對其作用機(jī)制的研究日益受到重視。
　　CD82由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞

2、內(nèi)區(qū)三部分組成。胞外區(qū)形成一個小環(huán)(smallextracellular loop，SEL)和一個大環(huán)(large extracellular loop，LEL);跨膜區(qū)為四個疏水的肽段;胞內(nèi)區(qū)包括N-端、C-端和一個細(xì)胞內(nèi)環(huán)。對CD82蛋白不同結(jié)構(gòu)域的作用進(jìn)行研究，對闡明其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理具有十分重要的理論意義。目前，對CD82胞外區(qū)大環(huán)結(jié)構(gòu)的功能研究較多，對CD82胞外區(qū)小環(huán)結(jié)構(gòu)功能的研究很少，其功能尚不明確。為弄清楚CD82

3、胞外小環(huán)結(jié)構(gòu)域在CD82抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，本論文采用化學(xué)方法合成CD82-SEL氨基酸序列模擬肽(CD82-SEL-P)，對其在細(xì)胞遷移、生長及凋亡中的作用進(jìn)行了研究。
　　1.CD82-SEL-P對貼壁生長、體外遷移運(yùn)動等的影響。
　　采用劃痕法、Boyden小室培養(yǎng)法，觀察了CD82-SEL-P對不同組織來源的腫瘤細(xì)胞貼壁生長、體外遷移運(yùn)動等的影響。
　　實驗結(jié)果:(1)發(fā)現(xiàn)CD82-SEL-P可顯著抑制各種貼

4、壁生長的腫瘤細(xì)胞的遷移運(yùn)動，其抑制作用與處理濃度呈正相關(guān)。(2)發(fā)現(xiàn)CD82-SEL-P可顯著抑制細(xì)胞的貼壁，轉(zhuǎn)而聚團(tuán)懸浮生長，其抑制細(xì)胞貼壁能力與處理濃度呈正相關(guān)。(3)發(fā)現(xiàn)CD82-SEL-P促進(jìn)懸浮生長的細(xì)胞聚團(tuán)生長。
　　結(jié)論:CD82-SEL-P能抑制體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞遷移運(yùn)動;抑制貼壁生長細(xì)胞的貼壁，轉(zhuǎn)而聚團(tuán)懸浮生長;促進(jìn)懸浮生長的細(xì)胞聚團(tuán)生長。且抑制作用均與處理濃度呈正相關(guān)。說明CD82-SEL可能是CD82與腫瘤轉(zhuǎn)

5、移抑制有關(guān)的重要結(jié)構(gòu)域，并且獨(dú)立的CD82-SEL就有腫瘤轉(zhuǎn)移抑制的功能。這一結(jié)論尚屬首次報道。
　　2.CD82-SEL-P對腫瘤細(xì)胞生長、增殖的影響。
　　采用細(xì)胞熒光組化及MTT法檢測了CD82-SEL-P對不同腫瘤細(xì)胞生長及形態(tài)的影響。
　　實驗結(jié)果:(1)CD82-SEL-P可使培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞收縮、胞漿出現(xiàn)顆粒、空泡，細(xì)胞與培養(yǎng)板剝離脫落。(2)CD82-SEL-P可以抑制各種貼壁培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖，其抑

6、制作用呈濃度依賴性。(3)CD82-SEL-P促進(jìn)懸浮生長細(xì)胞的生長、增殖。
　　結(jié)論:CD82-SEL-P對貼壁生長細(xì)胞和懸浮生長的細(xì)胞作用相反。CD82-SEL-P抑制體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞的生長增殖，促進(jìn)懸浮生長細(xì)胞的生長增殖。
　　3.以生物素標(biāo)記的CD82-SEL-P做探針，采用Western blot等技術(shù)分別檢測了CD82-SEL-P可能結(jié)合的膜蛋白和膜脂，以確定與CD82-SEL-P結(jié)合的靶分子。
　　實驗

7、結(jié)果:(1)Western blot結(jié)果顯示，生物素標(biāo)記的CD82-SEL-P探針可識別結(jié)合的蛋白有數(shù)十條之多且均為膜蛋白。(2)生物素標(biāo)記的CD82-SEL-P可結(jié)合到細(xì)胞總脂包被的硅膠小球，說明CD82-SEL-P識別結(jié)合的靶分子有脂類成份。
　　結(jié)論:CD82-SEL-P識別結(jié)合的特異結(jié)構(gòu)是寡糖鏈，其靶分子不是某個特異的蛋白或脂類分子，而是多個分子;包括糖蛋白和糖脂。
　　4.CD82-SEL-P誘導(dǎo)SW620和MDA

8、-MB-231腫瘤細(xì)胞凋亡以及機(jī)制研究。
　　觀察了CD82-SEL-P對SW620和MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，并對其機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　實驗結(jié)果:(1)細(xì)胞組化結(jié)果顯示，CD82-SEL-P可誘導(dǎo)SW620和MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞凋亡。(2)Western Blot分析結(jié)果顯示，CD82-SEL-P處理可增加SW620和MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞Caspase3和Caspase8的表達(dá)。(3)C

9、D82-SEL-P誘導(dǎo)SW620細(xì)胞凋亡同時發(fā)生線粒體膜電位的下降，提示CD82-SEL-P誘導(dǎo)SW620細(xì)胞凋亡可能牽涉到線粒體凋亡途徑。(4)CD82-SEL-P誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡同時有Caspase12和GRP78表達(dá)增高，提示CD82-SEL-P誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡可能牽涉到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑。
　　結(jié)論:(1)CD82-SEL-P可誘導(dǎo)SW620和MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。(2)CD82-SE