人參非皂苷成分治療老年癡呆作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：中國已進(jìn)入老齡化社會(huì)，且老年癡呆患病率呈逐年上升趨勢，這已經(jīng)嚴(yán)重的威脅了老年人的健康，同時(shí)也給患者、患者的家庭和社會(huì)帶來了巨大的精神與經(jīng)濟(jì)的壓力。人參作為我國名貴中藥材，已有四千多年的藥用歷史，且具有很好的促智作用。我們在文獻(xiàn)報(bào)道與前期的研究工作中發(fā)現(xiàn)，人參非皂苷部分具有增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶與治療老年癡呆的作用，為初步確定該活性組分的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了本項(xiàng)研究，這會(huì)為今后深入研究人參非皂苷部分治療老年癡呆的活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。
　　方法

2、：（1）首先稱取除皂苷后的人參水提物加入水?dāng)嚢枋怪芙猓缓笸ㄟ^離心、超濾、透析、濃縮、凍干后得到人參超濾液Y-1、1K透析外液Y-2與1K透析內(nèi)液Y-3；（2）水迷宮實(shí)驗(yàn)：向大鼠海馬區(qū)注射Aβ25-35建立老年癡呆模型，然后通過定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)測定大鼠爬上水下平臺休息的平均逃避潛伏期（AEL），AEL的長短反映了大鼠水下平臺的學(xué)習(xí)記憶能力；再將水下平臺撤去，通過空間探索實(shí)驗(yàn)測定大鼠通過水下平臺位置的次數(shù)；（3）活性組分的純化：對水迷宮篩選

3、出的活性組分用G-15葡聚糖凝膠柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，并繪制洗脫曲線；（4）理化性質(zhì)研究：對水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選出的活性組分進(jìn)行理化性質(zhì)研究，采用苯酚-濃硫酸法，在490 nm波長下測定對照品與供試品吸收度，計(jì)算回歸方程，然后將該成分的吸收度帶入到方程中計(jì)算中性糖含量；采用間羥基聯(lián)苯法，在525 nm波長下測定對照品與供試品吸收度，糖醛酸含量計(jì)算方法與中性糖含量計(jì)算方法相同；采用Lowery法，在660 nm波長下測定對照品與供試品吸收度，蛋白質(zhì)

4、含量計(jì)算方法與中性糖含量計(jì)算方法相同；（5）純度與分子量測定：采用高效液相凝膠色譜分析系統(tǒng)，并以牛血清蛋白（66430 Da）、VB12（1355.37 Da）、L-色氨酸（204.23 Da）、蛋白酶抑制劑（6500 Da）、細(xì)胞色素C（13000 Da）為對照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用GPC軟件計(jì)算樣品分子量分布；（6）組成糖分析：將活性組分采用PMP-柱前衍生化法制備成柱前衍生物，通過HPLC法測定其組成糖；（7）糖苷鍵連接方式分析：采

5、用氫氧化鈉法制備成部分甲基化樣品，再經(jīng)水解、還原、乙?；笾苽涑刹糠旨谆糠忠阴；苌?，通過GC-MS測定其糖苷鍵連接方式；（8）氨基酸分析：水解后制備成2,4-二硝基氟苯作為衍生物，通過高效液相法測定氨基酸組成。
　　結(jié)果：（1）水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果：定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Y-1組、Y-3組與模型組比較大鼠的平均逃避潛伏期均顯著縮短，其中Y-3組的AEL縮短的更為明顯；空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Y-1組與Y-3組大鼠的跨平臺次數(shù)比模型

6、組明顯增加，特別是Y-3組增加的更為顯著；（2）對活性組分進(jìn)行純化后得1K透析內(nèi)液A（Y-3A）與1K透析內(nèi)液B（Y-3B）兩部分，其中Y-3A含量大為1K透析內(nèi)液主要組成成分，根據(jù)其洗脫曲線判斷Y-3A為人參糖蛋白（3）理化性質(zhì)研究結(jié)果顯示，活性成分Y-3A的中性糖含量為19.11％，糖醛酸含量為6.79%，蛋白質(zhì)含量為51.60%；（4）純度與分子量測定結(jié)果表明，Y-3A為一混合物且分子量分布在400 Da–50000 Da之間；（

7、5）組成糖分析結(jié)果表明，Y-3A主要含有7種糖，分別為Man、Rha、GalA、Glc、GlcNAc、GalNAc、Fuc，其種Glc含量最多為51.32%。（6）糖苷鍵連接方式為，非還原末端由GalA、Glc構(gòu)成，糖鏈骨架由(1→2)-連接的Man、(1→3)-連接的Glc與(1→4)-連接的GalNAc/GlcNAc構(gòu)成，在(1→4,6)–連接的Man的C4或C6位存在分支點(diǎn)；（7）氨基酸分析結(jié)果：Y-3A由17種氨基酸組成，其中A

8、rg、Gly、Glu含量最多分別為39.45%、12.48%、10.58%。
　　結(jié)論：經(jīng)過水迷宮實(shí)驗(yàn)確定了治療老年癡呆的活性組分為1K透析內(nèi)液（Y-3），對其進(jìn)行進(jìn)一步純化表明，Y-3A為其主要成分，通過洗脫曲線判斷該成分為人參糖蛋白，對該人參糖蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、純度與分子量測定。對該糖蛋白進(jìn)行初步的結(jié)構(gòu)分析表明，其含有7種糖，其中葡萄糖含量最多，主鏈由(1→2)-連接的甘露糖、(1→3)-連接的葡萄糖與(1→4)-連接的葡萄糖