基于iTRAQ技術(shù)的脂多糖誘導(dǎo)早期內(nèi)毒素耐受相關(guān)蛋白的篩選.pdf

1、目的：構(gòu)建小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)毒素耐受和膿毒癥模型，使用iTRAQ技術(shù)分析內(nèi)毒素耐受狀態(tài)下與膿毒癥狀態(tài)下差異性蛋白的表達(dá)，探討早期內(nèi)毒素耐受機(jī)制。
　　方法：
　　1.用含10％胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.7，獲取活力良好的細(xì)胞后，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)濃度為5×105/ml，接種于6cm培養(yǎng)皿，使用隨機(jī)數(shù)字法分成2組，分別為內(nèi)毒素耐受組（耐受組）和膿毒癥組，

2、兩組種板后均用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。
　　2.24h后更換培養(yǎng)液，耐受組用含10ng/ml LPS的完全培養(yǎng)基3ml，預(yù)處理細(xì)胞24h，膿毒癥組用完全培養(yǎng)基3ml培養(yǎng)24h，24h后兩組再次更換培養(yǎng)液，用含100ng/ml LPS的完全培養(yǎng)基刺激細(xì)胞4h、24h；
　　3.刺激4h后，（1）離心，取細(xì)胞沉淀，于-80℃冰箱保存，收集培養(yǎng)液上清，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。（2）取培養(yǎng)液上清液行ELISA檢測(cè)

3、TNF-α、IL-6、IL-10。（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞膜上CD16/32表達(dá)。（4）提取蛋白，進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記，篩選出差異蛋白，然后使用生物信息學(xué)分析（GO注釋、KEGG信號(hào)通路，蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖、韋恩圖）。
　　4.刺激24h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞膜上CD16/32表達(dá)。
　　5.細(xì)胞處理及樣本留取采用3次生物學(xué)重復(fù)，收集和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，分析結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1.耐受組預(yù)處理后較膿毒癥組巨噬細(xì)胞

4、活化明顯，伸出偽足，表面積變大，貼壁更緊密。
　　2.ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子濃度：耐受組刺激4h時(shí)細(xì)胞上清中TNF-α水平(18273.5±10154.4pg/ml)較膿毒癥組(133233.7±68955.9pg/ml)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值<0.05，且細(xì)胞上清中IL-6水平(1549.8±399.2pg/ml)較膿毒癥組(3175.8±959.0pg/ml)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值<0.05；但I(xiàn)L-10水

5、平(351.1±184.2pg/ml)較膿毒癥組(220.3±121.4pg/ml)略有升高，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，P值>0.05。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞膜上CD16/32表達(dá)：耐受組刺激4h后細(xì)胞表面CD16/32陽(yáng)性率(75.33%)較膿毒癥組(49.69%)高，P<0.05；刺激24h細(xì)胞表面CD16/32陽(yáng)性率(79.07%)較膿毒癥組(94.27%)低，P<0.05，但與陰性對(duì)照組(54.11%)相比，膿毒癥組和耐受組

6、CD16/32均增高，P<0.05。
　　4.刺激4h后，用iTRAQ技術(shù)分析，兩組共鑒定到4086個(gè)蛋白，而耐受組與膿毒癥組的總蛋白比較，有63個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白，其中36個(gè)上調(diào)（比值>1.2），27個(gè)蛋白下調(diào)（比值<0.833）。
　　結(jié)果：
　　1.GO注釋?zhuān)翰町惖鞍椎纳飳W(xué)過(guò)程主要參與器官組織生長(zhǎng)發(fā)育、生物質(zhì)量調(diào)節(jié)、外界刺激反應(yīng)；分子功能主要是氧化還原酶激活、受體連接、DNA連接、抗氧化活性；細(xì)胞組分涉及染色質(zhì)

7、、胞外區(qū)、膜小泡、細(xì)胞質(zhì)囊泡。
　　2.KEGG信號(hào)通路分析63個(gè)差異蛋白共獲得112條信號(hào)通路，其中P<0.05的信號(hào)通路有27條，主要有TLR信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路以及PPAR信號(hào)通路。
　　3.蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中見(jiàn)HMGA1、HMGA2、HMGB1、HMGB2蛋白存在相互關(guān)聯(lián)。
　　4.韋恩圖中完全重疊部分共有差異蛋白35個(gè)，其中21個(gè)蛋白上調(diào)，14個(gè)蛋白下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1

8、.初始10ng/ml LPS預(yù)處理24小時(shí)，隨后100ng/ml LPS刺激4小時(shí)能誘導(dǎo)出巨噬細(xì)胞早期內(nèi)毒素耐受模型。
　　2.在內(nèi)毒素耐受早期狀態(tài)時(shí)促炎因子TNF-α、IL-6表達(dá)降低，IL-10水平略有升高。
　　3.使用iTRAQ技術(shù)能鑒定出蛋白并進(jìn)行早期內(nèi)毒素耐受差異蛋白的篩選，生物信息學(xué)對(duì)這些可能與早期內(nèi)毒素耐受相關(guān)的蛋白進(jìn)行分析，有助于總結(jié)可能參與內(nèi)毒素耐受的蛋白的功能、所在的細(xì)胞成分及蛋白間相互聯(lián)系、可能相關(guān)的