基于iTRAQ的胃癌多藥耐藥相關(guān)蛋白篩選研究.pdf

1、胃癌是全世界范圍內(nèi)惡性腫瘤死亡第二大原因，在中國(guó)居第三位，是嚴(yán)重威脅人民健康的一種惡性腫瘤?；熓穷A(yù)防胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的主要治療方法之一。多藥耐藥（Multidrug resistance，MDR）是胃癌化療失敗的主要原因。我們科前期以耐阿霉素和耐長(zhǎng)春新堿的胃癌細(xì)胞亞系7901/ADR和7901/VCR為模型，發(fā)現(xiàn)了一批胃癌多藥耐藥相關(guān)基因。然而目前ADR與VCR已經(jīng)逐漸退出臨床應(yīng)用，且已知的耐藥機(jī)制不能完全解釋對(duì)胃癌多藥耐藥機(jī)制，臨

2、床上也還沒有特別有效的胃癌MDR標(biāo)志物。因此，建立新的針對(duì)目前胃癌ECF化療方案的耐藥細(xì)胞系，并通過高通量篩選技術(shù)，篩選新的胃癌MDR的標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)，是MDR研究的主要方向之一，也是提高胃癌化療效果，延長(zhǎng)患者生存期的有效途徑?；诘鞍踪|(zhì)組學(xué)的iTRAQ技術(shù)能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本，篩選出MDR相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，可用于篩選胃癌MDR相關(guān)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。
　　本研究擬用SGC7901胃癌細(xì)胞系作為親本細(xì)胞，建立針對(duì)目前胃癌化療ECF方案

3、的主要化療藥物5-氟尿嘧啶、順鉑、表柔比星的耐藥細(xì)胞亞系；并通過我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)具備的iTRAQ技術(shù)，篩選與胃癌多藥耐藥相關(guān)的關(guān)鍵差異蛋白，運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法，找出這些可能參與的相關(guān)分子通路。
　　目的：
　　用SGC7901細(xì)胞作為親本細(xì)胞，建立5-氟尿嘧啶(5-FU)、順鉑(CDDP)、表柔比星（EPI）三個(gè)胃癌耐藥細(xì)胞亞系，利用基于蛋白質(zhì)組學(xué)的iTRAQ技術(shù)篩選胃癌多藥耐藥相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。
　　方法：
　

4、　采用我科前期懸浮培養(yǎng)的SGC7901胃癌干樣細(xì)胞重新貼壁培養(yǎng)，5-氟尿嘧啶，順鉑，表柔比星對(duì)胃癌細(xì)胞系SGC7901進(jìn)行耐藥誘導(dǎo)，5-氟尿嘧啶從終濃度0.4μg/ml開始，順鉑從0.08μg/ml開始，表柔比星4ng/ml開始，逐步增加藥物濃度，經(jīng)過12個(gè)月的藥物誘導(dǎo)，建立7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI三個(gè)胃癌耐藥細(xì)胞系。運(yùn)用MTT、凋亡實(shí)驗(yàn)、阿霉素蓄積與潴留實(shí)驗(yàn)、免疫熒光染色、免疫印跡、侵襲與遷移實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)方

5、法，對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定。通過iTRAQ技術(shù)對(duì)其差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行篩選，并運(yùn)用MetaCore等生物信息學(xué)分析軟件進(jìn)行信息學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.初步建立了7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI三個(gè)胃癌耐藥細(xì)胞亞系。7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI對(duì)5-氟尿嘧啶、順鉑、表柔比星的耐藥指數(shù)分別為5.2、9.6和11.6。此外，三個(gè)新耐藥細(xì)胞亞系對(duì)其他化療藥物也呈現(xiàn)不同的耐藥性。

6、r>　　2.三個(gè)新建立的耐藥細(xì)胞亞系的耐藥性與藥物排出功能和抗凋亡能力增強(qiáng)有關(guān)。與親本SGC7901細(xì)胞的排出指數(shù)0.14±0.01相比，7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI的排出指數(shù)分別為0.40±0.02（p<0.05），0.19±0.03（p>0.05），0.36±0.02（p<0.05）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其藥物排出能力的增強(qiáng)與耐藥細(xì)胞系中ABC家族蛋白MRP1的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。三個(gè)耐藥細(xì)胞系與親本SGC7901細(xì)胞

7、相比，均顯示較強(qiáng)的抗凋亡能力（p值均小于0.05）。Western blot顯示抗凋亡蛋白Bcl-2在7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI的表達(dá)與親本細(xì)胞相比明顯上調(diào)，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)明顯下調(diào)，提示抗凋亡機(jī)制影響三個(gè)耐藥細(xì)胞亞系的耐藥性。
　　3.長(zhǎng)期藥物誘導(dǎo)可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)三個(gè)耐藥細(xì)胞亞系的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯改變。F-actin熒光染色結(jié)果顯示，SGC7901細(xì)胞的

8、骨架蛋白排列整齊，而三個(gè)耐藥細(xì)胞亞系均有不同程度的細(xì)胞骨架排列紊亂。代表上皮表型的E-cadherin,β-catenin蛋白在SGC7901中表達(dá)較高，而在7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI均表達(dá)下調(diào)。相反，代表間質(zhì)表型的vimentin,slug,snail蛋白在SGC7901中表達(dá)較低，而在7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI均顯著上調(diào)，這些證據(jù)表明化療藥物可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT。進(jìn)一步研

9、究發(fā)現(xiàn)EMT增強(qiáng)了三個(gè)耐藥細(xì)胞系的遷移和侵襲能力。
　　4.篩選出了一批胃癌多藥耐藥的關(guān)鍵蛋白。我們進(jìn)行了兩次生物學(xué)重復(fù)的iTRAQ分析。在第一次iTRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，共檢出5930個(gè)蛋白。其中，與親本細(xì)胞SGC7901相比,在7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI三個(gè)耐藥細(xì)胞系中，蛋白表達(dá)差異倍數(shù)均大于1.2倍且經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p值均小于0.05的蛋白有18個(gè)；差異倍數(shù)均小于0.8倍且p值均小于0.05的蛋白有3

10、3個(gè)；第二次iTRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，共檢出5586個(gè)蛋白。其中，與親本細(xì)胞SGC7901相比，在7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI三個(gè)耐藥細(xì)胞系中，蛋白差異倍數(shù)均大于1.2倍的且p值均小于0.05的蛋白有19個(gè),倍數(shù)均小于0.8倍且p值均小于0.05的蛋白有25個(gè)。兩次質(zhì)譜的結(jié)果取交集，發(fā)現(xiàn)重復(fù)出現(xiàn)兩次上調(diào)的，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白有9個(gè)；重復(fù)出現(xiàn)兩次下調(diào)的，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白有10個(gè)。生物信息學(xué)對(duì)篩選得到的蛋白進(jìn)

11、行相關(guān)通路的富集分析顯示，未折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)通路，細(xì)胞骨架重構(gòu)通路，糖酵解和糖合成途徑，糖皮質(zhì)激素信號(hào)途徑等多條通路，可能參與胃癌耐藥。其中，endoplasmin和VCP蛋白參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的未折疊蛋白反應(yīng)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路，在多個(gè)富集分析方法中均顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示未折疊蛋白反應(yīng)可能是胃癌耐藥細(xì)胞緩解外界刺激壓力的重要途徑和耐藥相關(guān)的關(guān)鍵過程。細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白可能也參與胃癌多藥耐藥特性的形成，我們篩選到的vimentin和ker

12、atin等蛋白可能是影響細(xì)胞骨架改變和耐藥形成的關(guān)鍵蛋白，其中，vimentin的表達(dá)已經(jīng)得到了western blot的驗(yàn)證。
　　結(jié)論：
　　1.建立了7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI三個(gè)胃癌耐藥細(xì)胞亞系；發(fā)現(xiàn)采用懸浮培養(yǎng)后的細(xì)胞重新貼壁培養(yǎng)，可以增加耐藥細(xì)胞亞系的誘導(dǎo)成功率。
　　2.三個(gè)耐藥細(xì)胞亞系胃癌耐藥性的形成可能與MRP1相關(guān)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和Bcl-2/Bax介導(dǎo)的腫瘤抗凋亡機(jī)制增強(qiáng)

13、有關(guān)。
　　3.不同化療藥物誘導(dǎo)均能夠促使胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT，侵襲和遷移能力增強(qiáng)，提示化療藥物在殺滅大部分腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，可能促使小部分腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，最終導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的耐藥和轉(zhuǎn)移。
　　4.iTRAQ是胃癌多藥耐藥相關(guān)蛋白篩選的有效工具；通過兩次生物學(xué)重復(fù)的iTRAQ結(jié)果和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)endoplasmin、VCP等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白，可能作為分子伴侶，參與未折疊蛋白反應(yīng)，從而參與胃癌多藥耐藥。而vimenti