Toll樣受體4通過(guò)依賴(lài)NF-κB激活胱硫醚β合成酶介導(dǎo)腸易激綜合征大鼠的內(nèi)臟痛敏.pdf

1、目的：
　　腸易激綜合征（IBS）是一種以腹部不適伴排便習(xí)慣改變?yōu)樘卣鞯墓δ苄阅c病。近年來(lái)，隨著人們生活節(jié)奏的加快、飲食結(jié)構(gòu)的改變，神經(jīng)、精神、感染因素所致的腸易激綜合征發(fā)病率有上升趨勢(shì)，對(duì)患者的生活質(zhì)量和工作造成了很大的困擾。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖且孕律诮Y(jié)腸炎大鼠（NCI）為動(dòng)物模型，研究 Toll樣受體4與NF-κB調(diào)控內(nèi)源性硫化氫合成酶胱硫醚β合成酶（CBS）表達(dá)的上調(diào)，以及在新生期結(jié)腸炎性刺激誘導(dǎo)的慢性?xún)?nèi)臟痛覺(jué)中的作用。
　

2、　方法：
　　1.以出生10天的雄性SD大鼠為對(duì)象，肛門(mén)處插入2cm，結(jié)腸內(nèi)注射0.2ml的0.5％稀乙酸來(lái)建立內(nèi)臟痛覺(jué)高敏的模型，注射等容量的生理鹽水作為對(duì)照。待大鼠成年（6周）后，運(yùn)用腹壁撤回評(píng)分（AWR score）方法評(píng)測(cè)NCI大鼠的痛行為反應(yīng)。
　　2.運(yùn)用 Western blotting方法分析對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG，T13-L2)的Toll樣受體4，NF-κB，CBS蛋白表達(dá)量。
　　3.

3、結(jié)腸管壁注射熒光素（Dil）來(lái)逆行標(biāo)記結(jié)腸特異性背根節(jié)（DRG）神經(jīng)元，運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗方法檢測(cè)DRG神經(jīng)元的興奮性。
　　4.運(yùn)用免疫熒光的方法研究 Toll樣受體4是否與 NF-κB、CBS在結(jié)腸相關(guān)DRG（T13-L2）神經(jīng)元上共表達(dá)。
　　5.運(yùn)用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證在NCI大鼠的DRG中 NF-κB與CBS的啟動(dòng)子區(qū)特異性結(jié)合情況。
　　結(jié)果：
　　1. NCI增加腸相關(guān)DRG神經(jīng)元（T13-

4、L2）Toll樣受體4的表達(dá)。
　　2.行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射Toll樣受體4的拮抗劑CLI-095，能夠顯著降低NCI大鼠的內(nèi)臟痛覺(jué)高敏。
　　3.運(yùn)用電生理膜片鉗技術(shù)對(duì)腸特異性DRG神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4的拮抗劑CLI-095能顯著降低腸相關(guān)DRG神經(jīng)元的興奮性。
　　4.為了進(jìn)一步研究Toll樣受體4的作用機(jī)制，我們采用免疫熒光的方法發(fā)現(xiàn)Toll樣受體4與CBS在Dil標(biāo)記的腸相關(guān)DRG神經(jīng)

5、元上共表達(dá)，并且Toll樣受體4的拮抗劑CLI-095能夠翻轉(zhuǎn)NCI大鼠結(jié)腸相關(guān)DRG的CBS的表達(dá)。
　　5.免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4與NF-κB在Dil標(biāo)記的腸相關(guān)DRG神經(jīng)元上也有共表達(dá)，另外，western blotting結(jié)果顯示NCI能夠增加細(xì)胞核NF-κB，并且Toll樣受體4的拮抗劑CLI-095能夠翻轉(zhuǎn)這一增加。
　　6.腹腔注射N(xiāo)F-κB的拮抗劑PDTC，能夠減少CBS的表達(dá)，并且可以降低NCI

6、導(dǎo)致的內(nèi)臟痛覺(jué)超敏。
　　7.與對(duì)照組相比，染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示CBS與NF-κB的DNA結(jié)合位點(diǎn)在NCI大鼠腸相關(guān)DRG中的特異性結(jié)合顯著增強(qiáng)。
　　8.為了進(jìn)一步確認(rèn)Toll樣受體4的作用機(jī)制，我們運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)的方法，體外孵育Toll樣受體4的激動(dòng)劑脂多糖（LPS），發(fā)現(xiàn)LPS可以顯著增加NF-κB和CBS的表達(dá)，并且孵育NF-κB的拮抗劑PDTC可以翻轉(zhuǎn)CBS的增加，但是孵育CBS的拮抗劑AOAA并不能翻轉(zhuǎn)NF-κ