糖尿病腎病患者miR-29c-1207-5p的表達及其與IL-6、TNF-α表達的關(guān)系.pdf

1、背景：糖尿病腎?。―KD）是1型和2型糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一。目前中國糖尿病所致腎功能衰竭的比例快速增長，將會是我國未來導(dǎo)致終末期腎臟?。‥SRD）的首要病因。目前關(guān)于糖尿病腎病的發(fā)病機制尚未完全清楚，現(xiàn)普遍認為糖尿病受遺傳因素、長期持續(xù)高血糖導(dǎo)致腎臟血流動力學(xué)改變及炎癥反應(yīng)、糖脂代謝紊亂等因素有關(guān)。許多研究表明炎癥因子的激活與糖尿病腎病有密切的聯(lián)系，其中包括TNF-α、IL-18、IL-6等炎癥因子，炎癥反應(yīng)的調(diào)控在DKD的預(yù)防

2、及治療中具有一定的作用。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是近年發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性、非編碼單鏈小RNA，可與靶基因3’非編碼區(qū)（3’-UTR）的堿基互補配對，通過轉(zhuǎn)錄后水平引起信使 RNA（mRNA）的降解和（或）抑制mRNA進一步翻譯蛋白的過程，發(fā)揮負性調(diào)控靶基因蛋白表達的作用。越來越多的研究表明miRNAs的表達異?？赡軈⑴cDKD的發(fā)生、發(fā)展。Tristetraprolin（TTP）屬于RNA結(jié)合蛋白，由鋅指蛋白36（ZF

3、P36）基因編碼，能與IL-6、IL-18、TNF-α等炎性因子的mRNA3’UTR富含的AU堿基序列（AREs）區(qū)段結(jié)合，促進炎癥因子mRNA的降解，從而參與調(diào)控炎癥因子的表達。前期實驗研究 DKD患者的血、尿標(biāo)本中TTP的表達上調(diào)，炎癥因子IL-6、TNF-α的表達減少，二者呈負相關(guān)，證實TTP參與糖尿病腎臟疾病的炎癥反應(yīng)。結(jié)合miRNAs作用特點，考慮是否存在miRNAs可能通過作用TTP mRNA調(diào)控 TTP的表達，進而參與糖尿

4、病腎臟疾病的炎癥反應(yīng)。
　　目的：①經(jīng)上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿?Exiqon miRCURY LNATM microRNA Array芯片技術(shù)檢測血漿、尿沉渣及腎組織差異表達miRNAs，篩選與TTP mRNA結(jié)合的miRNAs：miR-29c及miR-1207-5p（miR-29c/1207-5p）并驗證。②檢測血漿及尿上清中炎癥因子IL-6、TNF-α表達水平。③探討血漿中miRNA-29c及miRNA-1207-5p與炎

5、癥因子IL-6的相關(guān)性。
　　方法：⑴自2014年10月至2015年7月期間，選取就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的實驗研究對象100例，早晨采集血、尿標(biāo)本。腎穿刺活檢確診為 DKD患者32例，收集腎內(nèi)科，其中10例患者留取腎穿刺組織標(biāo)本。正常對照組（NC組)35例，收集于體檢科，滿足相關(guān)臨床檢測指標(biāo)結(jié)果陰性的人群。NC組腎組織標(biāo)本選自同期行腎腫瘤切除患者10例，取遠離腫瘤5cm外的正常腎組織。單純糖尿病組（Diabetic Melli

6、tus,DM組）33例，收集于內(nèi)分泌科。⑵選取年齡、性別相匹配的DKD患者及健康體檢者各8人，將每組8人的血漿樣本混勻后取3ml，尿樣本同樣混勻后取3ml，同時選取DKD患者腎組織及NC組腎組織各3個，通過Exiqon miRCURY LNATM microRNA Array芯片技術(shù)檢測 miRNAs的表達譜，結(jié)合 miRBase、TargetScan等數(shù)據(jù)庫篩選出可以與TTP mRNA結(jié)合的2種miRNAs：miRNA-29c及miR

7、NA-1207-5p。⑶采用TRIzol Reagent抽提實驗研究對象血漿、尿沉渣及腎組織標(biāo)本中的總RNA，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測血漿、尿沉渣及腎組織中miRNA-29c、miRNA-1207-5p的表達水平。選擇miRNA-39作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-△△ct組間倍數(shù)關(guān)系計算。ELISA方法分別檢測血漿及尿上清中IL-6、TNF-α的濃度。分析血漿中miRNA-29c與miRNA-1207-5p的表達水平與炎癥因子IL-6相關(guān)性。

8、
　　結(jié)果：①Exiqon miRCURY LNATM microRNA Array結(jié)果：miRNA array結(jié)果信號強度達2倍以上兩組之間的差異：腎組織中，DKD組比NC組miRNAs上調(diào)15個，下調(diào)167個，血漿中，DKD組比NC組miRNAs上調(diào)103個，下調(diào)200個；尿沉渣中，miRNAs在DKD組比NC組上調(diào)770個，下調(diào)239個。應(yīng)用miRBase、TargetScan等數(shù)據(jù)庫中分析獲得 miRNA-29c、miRN

9、A-1207-5p可與TTP mRNA結(jié)合，可能調(diào)控TTP。②miRNA-29c與miRNA-1207-5p的表達水平：與NC組相比，DM組及DKD組患者血漿中miRNA-29c表達增多，miRNA-1207-5p表達減少，尿沉渣中 miRNA-29c表達減少，miRNA-1207-5p表達增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與DM組相比，DKD組患者血漿中 miRNA-29c表達增多，miRNA-1207-5p表達減少，尿沉渣中

10、 miRNA-29c表達減少，miRNA-1207-5p表達增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與NC組相比，DKD組患者腎組織中 miRNA-29c表達減少，miRNA-1207-5p表達增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。③IL-6、TNF-α濃度變化：DKD組患者血漿中 IL-6水平為70.397±2.196pg/m，顯著高于 NC組（3.685±0.47pg/ml）及 DM組（4.159±0.44pg/ml）。DKD

11、組血漿中TNF-α水平為37.087±3.12pg/ml，同樣顯著高于NC組（2.010±0.28pg/ml）、DM組（2.373±0.13pg/ml）。NC組、DM組及 DKD組尿液中 IL-6水平分別為2.373±0.58pg/ml，4.242±0.69pg/ml，6.176±0.66pg/ml，TNF-α水平分別為7.202±1.42pg/ml，11.241±1.53pg/ml，22.639±1.47pg/ml，DKD組與DM組、

12、NC組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。④miRNA-29c與 miRNA-1207-5p的表達水平及與 IL-6相關(guān)性：血漿中miRNA-29c表達水平與 IL-6表達呈正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.879，而miRNA-1207-5p與IL-6表達呈負相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為-0.818。
　　結(jié)論：⑴DKD患者腎組織及血、尿標(biāo)本中miR-29c及miR-1207-5p表達差異。⑵在DKD患者血漿中miRNA-1207-5p、miR