鹽酸阿比多爾減輕水通道蛋白-4抗體陽性血清的神經(jīng)毒性作用：體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、目的:視視神經(jīng)脊髓炎(Neuromyelitis optica，NMO)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘性自身免疫性疾病，常常引起視力下降和局灶神經(jīng)功能缺損。其主要發(fā)病機制是水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP4）抗體與星形膠質(zhì)細胞足突上的AQP4特異性結(jié)合誘發(fā)抗體依賴的細胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）和補體依賴的細胞毒性(Complement-depe

2、ndent cytotoxicity，CDC)作用，引起炎性反應(yīng)，血腦屏障破壞，從而導(dǎo)致髓鞘脫失，星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元壞死。目前NMO治療方法相對單一，主要包括免疫抑制劑，免疫調(diào)節(jié)劑和血漿置換，尚不能有效的預(yù)防NMO復(fù)發(fā)，且均未涉及其發(fā)病機制。近來，應(yīng)用AQP4轉(zhuǎn)染細胞及小鼠NMO模型研究發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑-鹽酸阿比多爾能夠阻斷AQP4抗體與AQP4的特異性結(jié)合，并有效減輕AQP4抗體介導(dǎo)的CDC及ADCC作用。而阿比多爾在原代皮層混合培

3、養(yǎng)和大鼠體內(nèi)NMO模型的作用如何尚未見報道，因此我們應(yīng)用SD(Sprague-Dawley)大鼠大腦皮層原代混合培養(yǎng)細胞及大鼠腦內(nèi)注射模型觀察鹽酸阿比多爾在體內(nèi)外對AQP4抗體神經(jīng)毒性的作用。
　　方法:常規(guī)培養(yǎng)新生SD大鼠大腦皮層細胞，用含有10％體積胎牛血清DMEM/F12制備成單細胞懸液，并種植于預(yù)先包被有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板（或24孔板）中，置37℃5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24h、72h換液，培養(yǎng)4d的細胞用于實驗

4、。實驗隨機分為4組，①正常血清組:原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)細胞4d后給予10％體積正常對照血清;②AQP4抗體陽性血清組:原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)細胞4d后給予10％體積抗體陽性性血清;③阿比多爾預(yù)處理組:阿比多爾依據(jù)12.5μM、25μM、50μM不同濃度分3個亞組。原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)細胞4d，分別加不同濃度阿比多爾處理1h后給予10％體積抗體陽性性血清;④二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)對照組(1％DMSO)，

5、原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)細胞4d，加入等體積DMSO預(yù)處理1h，各組細胞再培養(yǎng)6h后進行Hoechst33258/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染篩查阿比多爾最合適濃度，選?、壑凶钣行舛冉M及其余各組行細胞免疫熒光染色，觀察星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元變化。另使用SD大鼠腦內(nèi)注射AQP4陽性血清制備NMO動物模型，選取24只SD成年大鼠隨機分為4組，分別給予右側(cè)腦內(nèi)注射40μL正常人血清，右側(cè)腦內(nèi)注射40μLAQP4抗體陽性血

6、清，腹腔注射濃度為10mg/ml的阿比多爾(54mg/kg)干預(yù)3h后右側(cè)腦內(nèi)注射40μL抗體陽性血清，腹腔注射等體積濃度的DMSO預(yù)處理3h后右側(cè)腦內(nèi)注射40μL抗體陽性血清，各組大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)3天后斷頭取腦，冠狀切片，分別進行HE及免疫組織化學(xué)染色觀察灶局部炎性細胞及AQP4和神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達的變化，并測量病灶大小。
　　結(jié)果:
　　1、

7、篩查鹽酸阿比多爾最有效濃度
　　正常血清組及DMSO對照組均無明顯的細胞壞死，而AQP4抗體陽性血清組細胞壞死明顯;分別給予12.5μM、25μM、50μM濃度的鹽酸阿比多爾預(yù)處理壞死細胞均減少，以上各組總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=261.7，P＜0.05），組間比較顯示12.5μM與25μM的阿比多爾預(yù)處理組細胞存活率（64.24％和78.92％）分別與AQP4抗體陽性血清組(48.62％)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.0

8、1），而50μM阿比多爾預(yù)處理組存活率為(36.32％)，與AQP4抗體陽性血清組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.014)。
　　2、阿比多爾預(yù)處理對原代培養(yǎng)大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的影響
　　AQP4抗體陽性血清組星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元單個視野陽性細胞總面積分別為405.17±79.41μm2和295.26±43.31μm2均較正常血清對照組3226.85±334.56μm2和1990.03±63.27μm2明顯減少，差異

9、有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）;阿比多爾預(yù)處理組星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元陽性細胞總面積分別為1086.17±148.31μm2和955.75±132.05μn2，明顯高于AQP4抗體陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01），而DMSO組星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元陽性細胞總面積（2903.61±162.50μm2和1864.10±67.39μm2）與正常血清組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.102)。
　　3、腦內(nèi)注射AQP4抗體陽性血清產(chǎn)生

10、類似NMO病灶改變
　　HE染色顯示注射部位周圍可見廣泛的炎性細胞侵潤，而對側(cè)炎性細胞反應(yīng)不明顯。免疫組織化學(xué)染色示AQP4抗體陽性血清引起病灶內(nèi)AQP4和GFAP表達顯著缺失，病灶周圍GFAP表達顯著增加，正常血清組僅針道周圍GFAP表達活性增加，AQP4表達未見明顯缺失。
　　4、鹽酸阿比多爾預(yù)處理減少GFAP與AQP4表達缺失范圍
　　腦內(nèi)注射AQP4抗體陽性血清GFAP和AQP4染色缺失面積分別為15.5864

11、±0.72756和18.0692±1.21775(mm2)，較正常血清組4.6205±0.3178和3.8589±0.28073明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）;和AQP4抗體陽性血清組比較，鹽酸阿比多爾預(yù)處理組GFAP和AQP4染色缺失面積9.7107±0.41437和8.3793±0.59119明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、SD大鼠腦內(nèi)注射NMO患者AQP4抗體陽性血清能