頭孢曲松鈉減輕水通道蛋白4抗體對星形膠質細胞的毒性作用.pdf

1、目的:視神經脊髓炎(Neuromyelitis optica，NMO)是一種中樞神經系統(tǒng)自身免疫性炎性脫髓鞘性疾病，主要累及視神經和脊髓。自從發(fā)現NMO患者血清中存在特異性抗體即水通道蛋白(Aquaporin-4，AQP4)抗體以來，越來越多的證據表明其在NMO發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。AQP4抗體和星形膠質細胞突觸表面的AQP4結合能引起補體依賴性和抗體依賴性細胞毒性作用導致星形膠質細胞的死亡、炎癥細胞募集、細胞因子釋放和血腦屏障的破壞

2、，產生NMO病理改變。近年研究提示谷氨酸轉運體1（glial glutamate transporter-1，GLT-1）和谷氨酸興奮性毒性作用可能涉及NMO發(fā)病機制，但結論不一。眾所周知頭孢曲松鈉能上調星形膠質細胞的GLT-1表達，故本研究使用體外原代培養(yǎng)的新生SD大鼠(Sprague-Dawleyrats)大腦皮層神經細胞，觀察頭孢曲松鈉對AQP4抗體陽性血清誘導的星形膠質細胞毒性作用、GLT-1表達以及谷氨酸濃度的影響，探討頭孢曲

3、松鈉是否能減輕AQP4抗體對星形膠質細胞的毒性作用。
　　方法:常規(guī)方法提取出生后24h之內的SD大鼠的大腦皮層。將皮層神經細胞接種于直徑為35mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為含20％胎牛血清的DMEM/F12，在37℃CO2孵育箱中培養(yǎng)，分別在24h、72h、6d后更換培養(yǎng)液。實驗共分為4組:1.對照組:10％的比例加入健康人血清;2.AQP4抗體陽性組:10％的比例加入AQP4抗體陽性NMO患者血清;3.頭孢曲松鈉預處理組:給予AQP4

4、抗體陽性血清干預前10uM濃度頭孢曲松鈉干預48h;4.頭孢曲松鈉組:給予10uM濃度頭孢曲松干預48h后正常培養(yǎng)24h。細胞培養(yǎng)9d后進行免疫組織化學熒光染色。觀察不同實驗組星形膠質細胞形態(tài)和數目的變化;同時使用比色法測定上清液谷氨酸濃度，使用免疫印跡分析GLT-1表達水平。結果采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理，所有計量資料采用(x)±s表示，多組間單因素方差分析。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1 A

5、QP4抗體及頭孢曲松鈉對原代培養(yǎng)的大鼠皮層星形膠質細胞形態(tài)及數目的影響:
　　熒光顯微鏡下觀察，對照組星形膠質細胞外形清晰，突起粗壯;AQP4抗體陽性組星形膠質細胞胞體腫脹、突起斷裂甚至消失，而頭孢曲松鈉預處理組星形膠質細胞形態(tài)變化明顯減輕。對照組、AQP4抗體陽性組和頭孢曲松鈉預處理組星形膠質細胞數目分別為117.60±12.42個/視野、15.20±3.83個/視野和69.40±9.18個/視野，各組間比較差別均有統(tǒng)計學意義（

6、F值93.02 P均＜0.01）。而頭孢曲松鈉組并不引起星形膠質細胞形態(tài)學變化，星形膠質細胞數目（112.80±15.29個/視野）與對照組相比差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2 AQP4抗體及頭孢曲松鈉對原代培養(yǎng)的大鼠皮層細胞上清液中谷氨酸濃度的影響:
　　使用比色法測定不同實驗組細胞培養(yǎng)上清液中的谷氨酸濃度，研究發(fā)現AQP4抗體陽性組谷氨酸濃度(1356.30±330.95μM)較對照組(742.02±136.0

7、4μM)明顯升高(P＜0.01);頭孢曲松鈉預處理組谷氨酸濃度(676.89±176.90μM)與AQP4抗體陽性組比較有明顯下降(P＜0.01);頭孢曲松鈉組谷氨酸濃度（740.76±174.63μM）與對照組及頭孢曲松鈉預處理組比較差別均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。
　　3 AQP4抗體及頭孢曲松鈉對原代培養(yǎng)的大鼠皮層星形膠質細胞表面GLT-1表達的影響:
　　使用免疫印跡法分析AQP4抗體以及頭孢曲松鈉預處理對GL

8、T-1的表達的影響。研究顯示和對照組(0.69±0.16)比較，頭孢曲松鈉能明顯增加GLT-1表達（1.02±0.30，P＜0.01）;AQP4抗體陽性組GLT-1表達水平(0.52±0.15)較對照組明顯減少(P＜0.05);頭孢曲松鈉預處理組GLT-1表達水平(0.82±0.23)與AQP4抗體陽性組比較有明顯上調(P＜0.01);而頭孢曲松鈉預處理組與對照組比較差別無顯著統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結論:
　　1