高通量酵母雙雜交平臺的建立及其在蛋白質相互作用組學當中的應用.pdf

1、蛋白質通過相互作用所形成的具有一定拓撲結構的互相關聯的網絡是生物體進行復雜生命活動的基礎. 通過傳統的手段進行逐個的蛋白相互作用研究來逐步構建蛋白質相互作用圖譜是一件無法完成的任務,但是研究者又如何擺脫"盲人摸象"的尷尬,而從一個更加宏觀的角度審視全蛋白組范圍內的蛋白質相互作用的情況呢?高速發(fā)展的自動化技術為生物學研究者提供了全新的理念和手段.大多數的重復性試驗操作可以通過程序控制的機器人高效率自動化完成,這樣既把試驗人員從繁

2、重的實驗室勞動中解放出來,使他們有精力進行數據的整合和分析。 人類蛋白質組學計劃(Human Proteomics Project,HPP)是繼人類基因組學計劃之后,為了更加深入的解析人類生命活動的內在規(guī)律而啟動的又一項全世界范圍內的大型合作研究計劃.研究人員已經不再滿足于DNA水平的知識,將目光匯聚于蛋白質組的系統研究上來. 基因組中絕大部分基因及功能仍然處于未知狀態(tài),需要從蛋白質水平予以解釋.基因組決定生命體的基

3、本形式,而蛋白質組決定生命的多樣性、復雜性及其功能.蛋白質組是指"一種基因組所表達的全套蛋白質的集合".其研究可以實現與基因組的對接與確認,直接揭示人類重大疾患發(fā)生與發(fā)展的病理機制. 人類蛋白質相互作用圖譜(HumanProtein-Protein Interaction Map,HPPIM)是蛋白質組學計劃當中重要的一個組成部分.蛋白質相互作用組學在這個背景之下方興未艾.通過自動化高通量的技術平臺,研究者已經可以利用多種手段

4、構建人類蛋白質相互作用的連鎖圖,其中高通量酵母雙雜交就是一個重要的方法。傳統酵母雙雜交費時費力,無法完成組學計劃的任務. 本文在已有試驗技術的基礎上,逐步摸索并初步建立了大規(guī)模酵母雙雜交的技術平臺,并己應用到了人類蛋白質相互作用連鎖圖的構建過程中. 在此基礎上,本文獲得了大量的人類蛋白質相互作用數據,并且初步構建了人類蛋白質相互作用圖.后續(xù)的研究可以分為兩個方面：一對于其中的重要而且尚未報道的相互作用進行深入的研究,揭示其生理

5、生化意義；二利用積累的數據進行生物信息學分析和預測,對試驗結果進行分析和評估. 本論文以高通量酵母雙雜交技術平臺的初步建立過程入手,轉入對篩選得到的具體蛋白質相互作用進行深入研究. 首先,本文篩選得到了人類蛋白質MRK β與MSKl這對相互作用.MRKβ是MAPK途徑當MAKPKKK家族成員,它具有一個N端催化結構域,參與蛋白質的磷酸化修飾.MSKl是MAPK途徑當中關鍵的激酶,直接參與調控核內重要轉錄因子如CREB

6、、ATFl以及NFkBp65等的活性,并且是多種癌癥和炎癥的潛在藥物靶點. 最近已經成為研究的熱點.該蛋白包括兩個激酶結構域,通過一個調控序列連接起來.N端的結構域(N-terminal Kinase,NTK)屬于AGC激酶家族,參與對其底物的磷酸化.C端的結構域(C-terminalKinase,CTK)屬于CamK家族,目前認為它對N端有激活作用.通過生物信息分析本文發(fā)現,MRK β的N端激酶區(qū)域與p38、ERK的磷酸化結

7、構域具有高度的保守性.有報道推斷調控MSKl的除了p38和ERK1/2之外,目前為止似乎沒有其他蛋白參與這個過程的信號調控,而這與MSK1功能非常相似RSK則不同.RSK除了受到ERK的磷酸化調控之外還受到PDK1的磷酸化修飾,而PDKl與ERK,p38和MRK β在磷酸化的domain上具有高度的保守性.本文通過體外結合實驗、免疫共沉淀實驗和亞細胞免疫熒光共定位實驗證實了MRK β與MSKl之間的特異性相互作用,并且通過體外實驗發(fā)現M

8、RK β能夠將MSK1磷酸化.體外和體內試驗表明MRK β可以通過磷酸化激活MSKl,并且進一步激活下游的轉錄因子CREB. 這表明MRK β參與了MSK1的磷酸化過程,從而調控信號在細胞中的傳導,影響下游基因的轉錄.這對于經典的MAPK途徑中MSK1的激活途徑可能是一個新的發(fā)現和補充.本文進一步利用質譜技術鑒定了MRK B在MSK1上的磷酸化位點, 其次,本文還篩選得到了人類蛋白質MRK β與14-3-3 zeta

9、(WHAZ)的相互作用.利用上述方法本文也確定了二者之間的特異性相互作用.這對相互作用對于MRK B磷酸化MSKl的意義值得進一步的深入研究. 另外,本文也驗證了人類蛋白質CCNH與CtBP2之間的相互作用并且分析了這對相互作用的未來研究意義。 生物信息學正處于急速發(fā)展上升的階段,已經成為生命科學研究人員必不可少的工具和重要的方法,也成為了蛋白質組學當中不可或缺的重要組成部分,大量的試驗數據分析成為了生物研究者理解認

10、識蛋白質分類和功能的有力手段.結構域是蛋白質的基本組成部分,它具有三維的定義。首先,它應該是一段具有序列保守性的蛋白質序列(motif)；其次,它具有保守的結構特征；再次,它具有保守的功能.對結構域的研究和認識是理解蛋白質功能的主要方面。本文針對鏈霉菌噬菌體整合酶phiC31的結構域進行了預測,并結合該整合酶的識別序列特征,預測了將該系統應用于人類基因治療的風險.本文也利用動態(tài)規(guī)劃以及基于核方法的機器學習方法預測蛋白質結構域,并且以網絡