基于改進的高通量酵母雙雜交技術(shù)平臺研究人類肝臟重要蛋白質(zhì)的相互作用.pdf

1、肝臟是人體最大的代謝器官，在人體中具有不可替代的重要生理功能。研究肝臟內(nèi)重要蛋白質(zhì)的相互作用是理解肝臟生理功能與分子機制的基礎(chǔ)。本論文利用改進的高通量酵母雙雜交技術(shù)平臺來研究人肝臟重要蛋白質(zhì)的相互作用，為初步描繪人類肝臟重要蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖打下了一定的基礎(chǔ)。其內(nèi)容主要有以下幾個方面：(1)酵母雙雜交誘餌載體pDBlg的構(gòu)建：最初的雙雜交系統(tǒng)是invitrogen公司的PROQUSTTMTwo-hybridsystem，在此將其誘餌載

2、pDBLeu載體作出了改進：在其多克隆位點處引入兩個識別位點不一樣的Bsu36I酶切位點(利用Bsu36I識別位點中有可變堿基)，兩個Bsu36I酶切位點之間插入一個帶有強啟動子Prrn的GFP作為反選擇標記。所有感興趣的肝臟ORF經(jīng)過PCR擴增后(引物兩端加上TTAC與TGAC接頭)，經(jīng)過T4DNApolymerase處理后直接和經(jīng)Bsu36I酶切的載體相連。 (2)利用生物信息學(xué)分析結(jié)果，選取了與代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、氧化應(yīng)激、信

3、號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細胞周期調(diào)控等相關(guān)的肝臟基因430個，用PCR方法擴增這430個基因，PCR產(chǎn)物與pDBlg相連接，并測序驗證重組質(zhì)粒。 (3)430個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Mav203后，將430個mav203(pDB-x)進行自激活驗證后，利用改進的雙雜交系統(tǒng)，篩選人類肝臟cDNA文庫，對于篩選到的陽性克隆經(jīng)質(zhì)粒拯救、測序、Blast分析后共得到蛋白質(zhì)相互作用對471對，再次回溯到酵母體內(nèi)驗證，其陽性率約為60﹪。 (4