小麥類脫水素基因的克隆和WZY1-1抗體的制備.pdf

1、LEA蛋白是當(dāng)前植物胚胎學(xué)以及逆境生理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，胚胎晚期豐富蛋白(LEA蛋白)是一個(gè)大的基因家族，其表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)EA蛋白隨著種子脫水而合成的植物蛋白，其中一些蛋白能夠被干旱、高鹽、寒冷以及ABA等脅迫誘導(dǎo)。根據(jù)不同物種LEA蛋白的區(qū)域同源性將LEA分為六族。脫水素(dehydrin)屬于第二族LEA蛋白，能夠在植物胚胎發(fā)育后期以及逆境下大量表達(dá)，廣泛存在于植物界。它是具有高度熱穩(wěn)定性的親水性蛋白，有三類非常保守的區(qū)域，即K，Y和S

2、片段。脫水素作為一種脫水保護(hù)劑，能夠在干旱脅迫條件下穩(wěn)定細(xì)胞膜和許多大分子的結(jié)構(gòu)，以避免脫水對(duì)細(xì)胞造成的傷害。 本實(shí)驗(yàn)研究目的在于利用克隆的小麥脫水素基因構(gòu)建的原核表達(dá)載體，通過純化的表達(dá)蛋白制備抗體，為研究小麥不同時(shí)期脫水素基因的表達(dá)情況，以及在組織和細(xì)胞中的分布奠定基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)在已克隆的PUC<,M>-T-WZY1-1基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建小麥類脫水素基因wzy1-1的原核表達(dá)載體PET-32a(+)-WZY1-1，轉(zhuǎn)化

3、到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到融合蛋白，將純化后蛋白免疫兔子制得多克隆抗體，同時(shí)利用此抗體研究表達(dá)蛋白及小麥在干旱誘導(dǎo)和復(fù)水中脫水素基因的表達(dá)情況。通過研究表明： 1．得到一小麥的脫水素基因的克隆，構(gòu)建小麥脫水素基因wzy1-1的原核表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到目的融合表達(dá)蛋白，由于其特有的水溶性蛋白表達(dá)，所以為進(jìn)一步的純化提供了便捷。 2．小麥類脫水素在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，表達(dá)蛋白經(jīng)Ni<'

4、2+>瓊脂糖凝膠親和層析和透析袋電洗脫法純化后，對(duì)兔子進(jìn)行免疫，制備的抗血清通過ELISA檢測(cè)到較高的多克隆抗體效價(jià)。Western Blot結(jié)果顯示，利用純化的蛋白制備的兔抗血清可以很好的和所表達(dá)的蛋白帶特異性結(jié)合，而且也能與干旱脅迫處理后小麥葉片中的所表達(dá)的dehydrin蛋白特異性結(jié)合，證明其具有良好的免疫原性。 3．對(duì)鄭引1號(hào)小麥幼苗進(jìn)行干旱脅迫處理后，提取可溶性蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-PAGE電泳，Western-blot檢

5、測(cè)顯示，在分子量28kd處出現(xiàn)特異的蛋白條帶，隨著PEG脅迫時(shí)間延長，電泳蛋白條帶逐漸加深，雜交信號(hào)越來越強(qiáng)，表明可溶性蛋白含量增加，復(fù)水之后蛋白條帶逐漸變淺，可溶性蛋白含量降低。 4．干旱脅迫下，通過以L29152全長mRNA其中的一個(gè)ORF框?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)引物并通過RT-PCR克隆到了該基因，同時(shí)鑒定了該基因的核酸序列834bp，再構(gòu)建該基因的原核表達(dá)載體，通過誘導(dǎo)得到有活性的融合蛋白，說明此基因并非只能在冷脅迫下進(jìn)行表達(dá)，同