魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病大鼠心血管功能的改變及其相關(guān)機制研究.pdf

1、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以黑質(zhì)（substantia nigra，SN）多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元退行性變性死亡和殘存的神經(jīng)元內(nèi)形成Lewy小體（Lewy bodies，LBs）為主要病理特征。近年來許多研究表明，PD已不再是僅僅由于黑質(zhì)病變所致的區(qū)域性神經(jīng)疾病，而是累及中樞和外周的全身性疾病，在出現(xiàn)運動癥狀之前，98.6％的患者會出現(xiàn)一些非運動癥狀。PD

2、的非運動癥狀包括睡眠障礙、嗅覺障礙、心血管功能異常等，其中心血管功能異常的發(fā)生率占80%以上。PD常見的心血管功能異常包括過度的血壓變動、體位性低血壓、夜間高血壓和夜間血壓波動減少，但其出現(xiàn)的時間及導(dǎo)致該癥狀的原因尚不清楚。血壓的調(diào)節(jié)主要受到神經(jīng)和體液調(diào)節(jié)兩個方面因素的影響，其中神經(jīng)調(diào)節(jié)主要與多種心血管神經(jīng)反射活動有關(guān)，包括壓力感受性、化學感受性和容量感受性反射；而體液調(diào)節(jié)與腎素、血管緊張素、腎上腺素（epinephrine，E）和去甲

3、腎上腺素（norepinephrine，NE）等體內(nèi)多種激素的水平有關(guān)。心血管神經(jīng)反射性活動的多種感受器在接受刺激后，沿著迷走、舌咽神經(jīng)等傳入神經(jīng)到達延髓心血管中樞，繼而通過交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)等傳出神經(jīng)，調(diào)控包括心臟、血管和腎臟等多個功能臟器的活動，從而維持動脈血壓的相對穩(wěn)定。延髓心血管中樞包括延髓頭端腹外側(cè)區(qū)（rostral ventrolateral medulla，RVLM）、尾端腹外側(cè)區(qū)（caudal ventrolateral

4、 medulla，CVLM）和孤束核（nucleus tractus solitarii，NTS）。該區(qū)域含有包括谷氨酸能神經(jīng)元、γ-氨基丁酸能神經(jīng)元和兒茶酚胺能神經(jīng)元在內(nèi)的多種類型的神經(jīng)元，其中兒茶酚胺能神經(jīng)元被認為與包括壓力感受性反射活動在內(nèi)的多種心血管活動的調(diào)節(jié)有直接的關(guān)系。研究表明，PD出現(xiàn)心血管癥狀的原因包括外周和中樞兩個方面，外周機制的研究集中在交感神經(jīng)節(jié)及其傳出神經(jīng)的損傷上，而中樞機制的研究則集中在延髓心血管中樞兒茶酚胺能

5、神經(jīng)元的變化上。而在 PD中，延髓心血管中樞兒茶酚胺能神經(jīng)元損傷的部位報道不統(tǒng)一。有的研究發(fā)現(xiàn)，RVLM區(qū)及中縫背側(cè)區(qū)的苯乙醇胺氮甲轉(zhuǎn)位酶（phenylethanolamine-N- methyltransferase，PNMT）陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯下降，但延髓頭端背外側(cè)區(qū)和NTS部位卻沒有明顯變化。也有研究發(fā)現(xiàn)，RVLM區(qū)和延髓尾端背外側(cè)區(qū)的酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）陽性細胞數(shù)明顯下降。還有研究指出，

6、CVLM區(qū)和延髓尾端背外側(cè)區(qū)TH陽性細胞數(shù)目沒有變化；或CVLM區(qū)和RVLM區(qū)兒茶酚胺能細胞數(shù)目沒有減少，但延髓尾端背外側(cè)區(qū)和延髓頭端背外側(cè)區(qū)兒茶酚胺能細胞數(shù)目有中等程度的減少。因此，闡明 PD中心血管中樞兒茶酚胺能神經(jīng)元是否有損傷，損傷出現(xiàn)的時間，與 PD的非運動癥狀心血管功能改變之間的關(guān)系，并深入揭示其機制，對PD的早期診斷和早期預(yù)防具有重要的意義。
　　本研究驗采用魚藤酮制備的PD大鼠模型，首先通過免疫熒光和免疫印跡技術(shù)觀察

7、 SN區(qū)TH陽性細胞數(shù)和TH蛋白表達的變化，通過免疫組織化學技術(shù)觀察紋狀體（striatum，Str）區(qū)TH陽性神經(jīng)纖維末梢的改變，通過高效液相色譜電化學檢測技術(shù)（high-performance liquid chromatography electrochemical detection，HPLC-ECD）觀察Str區(qū)DA及其代謝產(chǎn)物含量的變化，通過方橋?qū)嶒灪蜁鐖鰧嶒灥燃夹g(shù)觀察動物運動行為的變化，明確SN-Str系統(tǒng)損傷以及動物運動

8、障礙出現(xiàn)的時間。進而利用動物心電圖檢測和在體血壓監(jiān)測技術(shù)觀察不同時間點PD大鼠心律變異性（heart rate variability，HRV）和平均動脈壓（mean blood pressure，MBP）的變化；進一步通過免疫熒光和免疫印跡技術(shù)觀察RVLM、CVLM和NTS區(qū)兒茶酚胺能神經(jīng)元數(shù)目的變化以及α-突觸核蛋白（α-synuclein,α-Syn）的表達。進一步將攜帶突變型α-Syn的腺病毒過表達載體立體定位注射至 RVLM區(qū)

9、，再次觀察相關(guān)指標的變化，以期闡明 PD心血管功能異常出現(xiàn)的時間及其相關(guān)機制。
　　本研究表明：⑴在魚藤酮制備的PD大鼠模型中，魚藤酮注射7、14和21天后，SN區(qū)TH陽性細胞數(shù)分別減少了31%、52%和73%；TH蛋白表達水平分別減低了17%、30%和68%，與對照組相比，差別有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。魚藤酮注射7天后，Str區(qū)TH免疫陽性神經(jīng)纖維末梢明顯減少。⑵在魚藤酮制備的PD大鼠模型中，魚藤酮注射14和21天后，S

10、tr區(qū)DA含量由2.02±0.58 ng/mg分別減少到0.89±0.31 ng/mg和0.44±0.15 ng/mg，DOPAC含量由0.80±0.25 ng/mg分別下降到0.49±0.10 ng/mg和0.48±0.09 ng/mg，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；魚藤酮注射21天后，HVA含量由0.53±0.19 ng/mg下降到0.35±0.12 ng/mg，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。⑶在

11、魚藤酮制備的PD大鼠模型中，魚藤酮注射13和20天后，方橋?qū)嶒灉魰r間和曠場實驗移動速度都明顯降低，差別有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。⑷在魚藤酮制備的PD大鼠模型中，魚藤酮注射7、14和21天后，低頻（low-frequency power，LF）頻段下降，高頻頻段（high-frequency power，HF）增加，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而標準化LF（normalized LF power，LFnu）和

12、LF/HF比值出現(xiàn)顯著降低（P<0.01）。⑸在魚藤酮制備的PD大鼠模型中，魚藤酮注射3天后，MBP開始下降，注射11天后降至最低點，至第21天稍有恢復(fù)。魚藤酮注射3、7、14和21天后，血漿中NE含量由0.65±0.23 mg/mL分別下降到0.40±0.19 mg/mL，0.28±0.14 mg/mL，0.20±0.14 mg/mL和0.23±0.16 mg/mL。魚藤酮注射7、14和21天后，血漿中E含量由0.35±0.10 mg

13、/mL分別減少到0.16±0.08 mg/mL，0.15±0.13 mg/mL和0.16±0.13 mg/mL，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。血漿中NE（r=0.466,P<0.01）和E（r=0.662，P<0.01）的含量與MBP之間呈正相關(guān)。⑹在魚藤酮制備的PD大鼠模型中，魚藤酮注射7、14和21天后，RVLM區(qū)多巴胺β羥化酶（dopamine beta hydroxylase，DBH）陽性神經(jīng)元數(shù)目分別減少了3

14、7%，50%和58.5%，DBH蛋白表達水平分別減少了33%，47%和63%，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。魚藤酮注射7和14天后，CVLM區(qū)DBH陽性神經(jīng)元數(shù)目和DBH蛋白表達沒有明顯變化，21天后出現(xiàn)降低。魚藤酮注射21天后，NTS區(qū)DBH陽性神經(jīng)元數(shù)目和DBH蛋白表達水平未出現(xiàn)明顯的變化。各部位TH陽性神經(jīng)元數(shù)目和蛋白表達量的變化也觀察到同樣的結(jié)果。⑺在魚藤酮制備的PD大鼠模型中，魚藤酮注射21天后，RVLM區(qū)α

15、-Syn陽性細胞數(shù)目增加了42%，α-Syn蛋白表達水平增加了27%，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。⑻大鼠RVLM區(qū)立體定向注射α-Syn過表達腺病毒ADV4-SNCA，注射3天后，MBP開始下降，4天后降至最低點，至第8天稍有恢復(fù)，與對照組相比，差別有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。注射8天后，RVLM區(qū)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目降低了43%，TH蛋白表達水平降低了37%，α-Syn蛋白表達水平增加了99%，差別有高度統(tǒng)計學