Hsa-let-7g對(duì)甲基丙二酸血癥中MMACHC影響的研究.pdf

1、研究背景：
　　甲基丙二酸血癥（Methylmalonic acidemia，MMA）是有機(jī)酸血癥中最常見(jiàn)的類(lèi)型，屬于常染色體隱性遺傳。根據(jù)代謝酶缺陷的不同，將MMA分為甲基丙二酰輔酶A變位酶（MCM）缺陷及其輔酶鈷胺素（cobalamin，cbl）代謝障礙兩大類(lèi)。鈷胺素代謝障礙又根據(jù)其不同活性形式的損傷分為甲基鈷胺素
　　（MeCbl）缺陷和腺苷鈷胺素（AdoCbl）缺陷兩類(lèi)。其中甲基鈷胺素（MeCbl）缺陷臨床表現(xiàn)為甲基

2、丙二酸血癥合并高同型半胱氨酸血癥，包括CblC、CblD和CblF三個(gè)臨床亞型。MMACHC、MMADHC、LMBRD1基因突變分別是導(dǎo)致cblC亞型、cblD亞型和CblF亞型發(fā)病的遺傳基礎(chǔ)。在我國(guó)大陸的最常見(jiàn)的是cblC亞型。
　　MicroRNAs參與諸多生物學(xué)過(guò)程。Let-7作為miRNA家族中的重要成員之一，在腫瘤、炎癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。有研究認(rèn)為，Let-7是MMA的可能生物標(biāo)志物。本研究著眼于Le

3、t-7家族成員之一hsa-let-7g在晚發(fā)型甲基丙二酸血癥合并高同型半胱氨酸血癥疾病中所起的調(diào)控作用。進(jìn)而探討hsa-let-7g在MMA中的具體生物學(xué)功能，為hsa-let-7g在MMA的臨床診斷、治療、預(yù)后評(píng)估提供理論基礎(chǔ)。
　　主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下
　　第一部分Hsa-let-7g在甲基丙二酸血癥患者血漿的表達(dá)特征
　　目的：
　　對(duì)hsa-let-7g在甲基丙二酸血癥患者血漿的表達(dá)特征進(jìn)行研究。

4、>　　方法：
　　選取2011年8月到2016年1月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院及鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及兒科住院治療的晚發(fā)型MMA患者21例為病例組，所有患者經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）明確診斷并于治療3周后復(fù)查。選擇患者同年齡段未患病健康親屬19例作為對(duì)照組。留取血漿，采用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定hsa-let-7g的血漿表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1. GC/MS結(jié)果提示，MMA組治療前尿甲基丙二酸值倍率2360.532

5、±1589.506，
　　治療后所有患者尿甲基丙二酸值倍率均不同程度的降低，為624.540±420.946，兩者有顯著性差異（P<0.01）。對(duì)照組尿甲基丙二酸值倍率均小于100，為8.284±2.615，與MMA組治療前、后均有顯著性差異（P<0.01）。
　　2. Q-PCR結(jié)果提示：與健康對(duì)照組相比較，hsa-let-7g在治療前組呈高表達(dá)（p<0.01）。治療前組與治療后組相比較，hsa-let-7g在進(jìn)行治療后表

6、達(dá)有所下降（p<0.01）。
　　結(jié)論：
　　Hsa-let-7g在合并高同型半胱氨酸血癥的甲基丙二酸血癥患者血清中呈現(xiàn)高表達(dá)，治療后表達(dá)水平明顯下降。
　　第二部分Hsa-let-7g與靶基因關(guān)系的驗(yàn)證
　　目的：
　　對(duì)hsa-let-7g的可能靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)并對(duì)兩者關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。方法
　　1過(guò)Ensemble Genome Brower database對(duì)hsa-let-7g的基因序列進(jìn)行查找，

7、并通過(guò)分子生物學(xué)方法對(duì)hsa-let-7g在MMA中的可能靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)
　　2基于預(yù)測(cè)結(jié)果，將與hsa-let-7g的seed區(qū)域相結(jié)合的MMACHC3'UTR作用位點(diǎn)及作用位點(diǎn)堿基突變的片段克隆到psiCHECK2質(zhì)粒上，構(gòu)建了含hsa-let-7g作用位點(diǎn)的MMACHC3'UTR熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)載體，并同時(shí)構(gòu)建了其作用位點(diǎn)突變的載體MMACHC-3'-UTR-MUT作為陰性對(duì)照。應(yīng)用psi-CHECK2載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過(guò)

8、對(duì) psicHECK2載體所表達(dá)的熒光素酶的活性進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.甲基丙二酸血癥cblC亞型致病基因MMACHC是hsa-let-7g的可能靶基因。
　　2.成功構(gòu)建含有3'UTR MMACHC的熒光素酶報(bào)告載體系統(tǒng)。mir組與空白組相比較，*P<0.05，mir組與NC組相比，*P<0.05，hsa-let-7g能通過(guò)結(jié)合MMACHC基因3?UTR影響其熒光活性改變。hsa-let-7g inhibit

9、or組與空白組相比，**P<0.01，hsa-let-7g inhibitor組與NC inhibitor組相比，*P<0.05，hsa-let-7g inhibitor能封閉hsa-let-7g抑制其與MMACHC基因3‘UTR結(jié)合，從而影響螢光素酶的活性。
　　3.成功構(gòu)建含有mut3'UTR MMACHC的熒光素酶報(bào)告載體系統(tǒng)。mir組與空白組和NC組相比較，P>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。hsa-let-7g不能通過(guò)結(jié)合mut

10、3'UTR MMACHC基因3?UTR影響其熒光活性改變，結(jié)合位點(diǎn)突變完全。
　　結(jié)論：
　　MMACHC基因是Hsa-let-7g的可能靶基因。
　　第三部分 hsa-let-7g對(duì)MMACHC表達(dá)趨勢(shì)的影響
　　目的：
　　在前兩部分研究的基礎(chǔ)上，研究hsa-let-7g對(duì)MMACHC基因的表達(dá)趨勢(shì)的影響。
　　方法：
　　在人胚胎腎細(xì)胞293T中，分別轉(zhuǎn)染hsa-let-7g及Hsa-le

11、t-7g inhibitor并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（Q-PCR）對(duì)MMACHC基因?qū)?yīng)RNA及hsa-let-7g表達(dá)水平分別進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用Western Blotting研究技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中MMACHC蛋白質(zhì)組分的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組相比，hsa-let-7g mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MMACHCmRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)（p<0.05）；hsa-let-7g inhibitor轉(zhuǎn)

12、染組MMACHCmRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)（p<0.05）。
　　2.轉(zhuǎn)染hsa-let-7g mimics后48 h，與對(duì)照組mimics negative control相比較，實(shí)驗(yàn)組中hsa-let-7g的水平明顯升高(p<0.05)。
　　3.Western Blotting示人胚胎腎細(xì)胞293T中GAPDH（內(nèi)參）的表達(dá)不受hsa-let-7g的影響，MMACHC蛋白的表達(dá)受到hsa-let-7g的負(fù)向調(diào)節(jié)，差異具有