胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)(Ⅱ段)中動(dòng)物易感陽(yáng)性對(duì)照品優(yōu)化匹配性及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、1.目的：
　　 比較敵枯雙和環(huán)磷酰胺兩種陽(yáng)性對(duì)照藥物致畸敏感性,為大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)(Ⅱ段生殖毒性)中設(shè)置適當(dāng)?shù)膬?yōu)化匹配的陽(yáng)性對(duì)照品作依據(jù),并對(duì)其發(fā)生的可能機(jī)制進(jìn)行研究。
　　 2.方法：
　　 挑選成年健康雌雄SD大鼠以1:1的比例在當(dāng)日下午17:00時(shí)后合籠交配,于次日晨檢查陰栓和涂片,查到陰栓或涂片查到精子者的確定為交配成功,交配成功日為孕D0。雌性SD大鼠60只,分為6組,其中設(shè)陰性對(duì)照兩組,分

2、別給予0.5％的羧甲基纖維素鈉(CMC)灌胃和生理鹽水尾靜脈注射;敵枯雙兩組于孕D10,分別灌胃給予敵枯雙11.0mg/kg和13.8mg/kg;環(huán)磷酰胺兩組于孕D10,分別尾靜脈給予環(huán)磷酰胺7.2mg/kg和9.0mg/kg;從孕D0開(kāi)始稱重,以后每3d稱體重1次。在孕D20用3％戊巴比妥納注射液麻醉處死孕鼠,解剖,取出胎仔,檢查黃體數(shù)、子宮連胎仔重、胎盤重量、活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)、活胎重量、頂臀長(zhǎng)及外觀和骨骼畸形,制備孕鼠血清用

3、于血SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)、NO(一氧化氮)的測(cè)定。每組1/3的胎仔經(jīng)茜素紅染色后進(jìn)行骨骼畸形檢查,2/3的胎仔去除內(nèi)臟后放入4％甲醛溶液固定兩周后做脊髓病理切片觀察脊髓病理組織學(xué)改變;采用免疫組化SABC法檢測(cè)敵枯雙組胎仔脊髓PCNA(增殖細(xì)胞核抗原)蛋白表達(dá)和環(huán)磷酰胺組胎仔脊髓凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá),以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀態(tài)。神經(jīng)細(xì)胞凋亡用凋亡指數(shù)(AI)表示,AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％。

4、基因Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)強(qiáng)度用平均灰度值G表示,蛋白表達(dá)越強(qiáng)G值越小。
　　 3.結(jié)果：
　　 敵枯雙低劑量組和高劑量組胎仔發(fā)生的骨骼畸形率分別是92.59％和100％,分別與環(huán)磷酰胺低劑量和高劑量組胎仔骨骼畸形率78.5％和100％相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0,05),敵枯雙低劑量組和高劑量組胎仔發(fā)生的外觀畸形率分別是84.62％和86.84％,外觀畸形率比環(huán)磷酰胺低劑量和高劑量組2.6％和0.0％增高(P＜0.0

5、1),而且敵枯雙組胎仔畸形種類較多,如:四肢短小、心臟外露、臍疝、腹裂、顯性脊柱裂、尾畸形(無(wú)尾、卷尾、短尾)、肛門閉鎖等,骨骼畸形有顱骨發(fā)育不全、肋骨畸形(分叉肋、融合肋、缺肋)、脊柱骨缺失(尾椎缺失、腰椎缺失)、胸骨發(fā)育遲緩等;環(huán)磷酰胺組外觀畸形發(fā)生的較少,唇裂;骨骼畸形較明顯,以顱骨發(fā)育不全、胸骨發(fā)育遲緩為主。
　　 從光鏡下觀察,敵枯雙低劑量組胎仔的胸髓和腰髓病理切片中分別發(fā)現(xiàn)有82.35％(14/17)和75％(12/

6、16)出現(xiàn)中央管消失或偏移,基板、翼板分界不清、神經(jīng)細(xì)胞明顯減少,脊髓嚴(yán)重萎縮等病理改變(P＜0.01)?？蓦p高劑量組的胸髓和腰髓病理切片中分別發(fā)現(xiàn)有66.67％(4/6)和100％(7/7)出現(xiàn)上述病理改變(P＜0.01)。環(huán)磷酰胺兩個(gè)劑量組胎仔的脊髓病理切片均未發(fā)現(xiàn)畸形病變。
　　 脊髓凋亡的神經(jīng)細(xì)胞核體縮小散在于脊髓中,凋亡神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)清晰可見(jiàn)深藍(lán)色顆粒,凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離,陰性對(duì)照CMC組胎仔胸髓和腰髓前角凋亡指數(shù)為

7、0.8％和0.6％,與敵枯雙低劑量組胎仔的胸髓和腰髓前角凋亡指數(shù)0.7％和0.5％和敵枯雙高劑量組胎仔的胸髓和腰髓前角凋亡指數(shù)0.5％和0.9％相比,均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。環(huán)磷酰胺低劑量組胎仔的胸髓和腰髓細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為3.1％和3.9％,與生理鹽水組胎仔的胸髓和腰髓細(xì)胞凋亡指數(shù)0.5％和0.7％相比明顯增加(P＜0.01)。
　　 通過(guò)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率,結(jié)果顯示PCNA主要在脊髓細(xì)胞核上表達(dá)呈黃褐色,并在灰質(zhì)和白

8、質(zhì)中均有表達(dá),CMC組胎仔胸髓和腰髓細(xì)胞與敵枯雙低劑量組和高劑量組胎仔胸髓和腰髓細(xì)胞的PCNA表達(dá)無(wú)明顯差別(P＞0.05)。
　　 Bcl-2和Bax主要在胎仔脊髓的前角細(xì)胞的胞漿中表達(dá),生理鹽水組胎仔胸髓和腰髓前角細(xì)胞的Bcl-2和Bax表達(dá)灰度值G值分別是Bcl-2(120.46±10.08和124.84±11.23),Bax(141.76±10.13和139.86±13.89);環(huán)磷酰胺低劑量組胎仔胸髓和腰髓前角細(xì)胞的B

9、ax表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01),灰度值G值分別為106.68±8.76和107.30±11.27。環(huán)磷酰胺低劑量組胎仔胸髓前角細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)明顯減弱(P＜0.01),灰度值G值為141.93±13.73;環(huán)磷酰胺低劑量組胎仔腰髓前角細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)較弱(P＜0.05),灰度值G值為134.82±9.67。
　　 環(huán)磷酰胺低劑量組孕鼠血清中MDA含量與生理鹽水組MDA無(wú)差別(P＞0.05),環(huán)磷酰胺高劑量組孕鼠血清中M

10、DA含量均顯著高于生理鹽水組和環(huán)磷酰胺低劑量(P＜0.01)。環(huán)磷酰胺低劑量組和高劑量組孕鼠血清NO濃度顯著高于生理鹽水組(P＜0.05),環(huán)磷酰胺低劑量組孕鼠血清中的SOD活性明顯高于生理鹽水組(P＜0.01),而環(huán)磷酰胺高劑量組孕鼠血清中的SOD活性明顯低于生理鹽水組(P＜0.01)。
　　 4.結(jié)論：
　　 (1)與環(huán)磷酰胺比較,敵枯雙為SD大鼠較為敏感的致畸陽(yáng)性藥物,在孕D10給予11mg/kg敵枯雙一次性灌胃為

11、最理想的陽(yáng)性對(duì)照設(shè)計(jì)方案。
　　 (2)敵枯雙和環(huán)磷酰胺均有母體毒性及胚胎毒性,敵枯雙和環(huán)磷酰胺用藥途徑、劑量差異較大,在用藥時(shí)間相同情況下導(dǎo)致不同類型畸形,提示兩種藥物在體內(nèi)代謝途徑不同,可能通過(guò)不同途徑導(dǎo)致畸形的發(fā)生。
　　 (3)同等條件下,敵枯雙誘導(dǎo)胎仔產(chǎn)生的多個(gè)靶組織(尾、肋骨和胸骨)的缺失或畸形和脊髓畸形,推測(cè)兩者可能有內(nèi)在聯(lián)系。在本研究條件下,我們發(fā)現(xiàn)敵枯雙導(dǎo)致神經(jīng)管未閉和脊髓畸形與細(xì)胞凋亡機(jī)制沒(méi)有明顯關(guān)系

12、。
　　 (4)環(huán)磷酰胺的神經(jīng)管致畸劑量在7.2mg/kg至9.0mg/kg之間,若能選擇一個(gè)合適的劑量很有可能誘導(dǎo)出脊髓畸形的模型。在環(huán)磷酰胺作用下脊髓神經(jīng)細(xì)胞過(guò)度凋亡,提示神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)度凋亡與脊椎裂畸形的發(fā)生密切相關(guān)。
　　 (5)環(huán)磷酰胺組脊髓神經(jīng)細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)強(qiáng),Bcl-2蛋白表達(dá)弱,有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用;而正常胎仔脊髓神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)強(qiáng),Bax蛋白表達(dá)弱,抑制神經(jīng)細(xì)胞過(guò)度凋亡;可見(jiàn),在脊椎裂畸形發(fā)