P-糖蛋白在健康和大腸桿菌感染肉雞組織中的表達差異及其對口服恩諾沙星藥動學的影響.pdf

1、P-gp是由Abcb1基因編碼的一種相對分子質(zhì)量為170 kda的跨膜轉運蛋白，屬于能量依賴的藥物外排泵。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，P-gp除了在腫瘤細胞中高表達介導其對化療藥物的耐藥外，人和動物的正常組織中也有分布，如膽小管、腸上皮、腎小管以及血腦屏障等，可限制藥物及其它外源性物質(zhì)在生物體內(nèi)的吸收、分布和排泄，是影響口服藥物生物利用度的一個重要因素。P-gp的表達可以受到多種因素影響，包括化學物質(zhì)、年齡、性別、生理狀態(tài)、疾病以及激素等。目前關

2、于大腸桿菌感染對肉雞體內(nèi)P-gp表達和功能的影響以及對口服底物藥物藥動學過程的研究仍較少，故本試驗研究了大腸桿菌感染對肉雞P-gp mRNA表達的影響及其對恩諾沙星在肉雞體內(nèi)藥動學的影響，并初步探討了大腸桿菌對P-gp mRNA表達影響的調(diào)控機制。
　　首先，采用P-gp誘導劑利福平以及抑制劑維拉帕米研究其對恩諾沙星在肉雞體內(nèi)藥動學的影響，證實恩諾沙星為P-gp的底物。本研究選取30只健康8周齡肉雞，隨機分為6組(n=5)，分別為

3、單劑量口服恩諾沙星(10 mg/kg.bw)組、單劑量口服維拉帕米(15 mg/kg.bw)后口服恩諾沙星(10 mg/kg.bw)組、單劑量口服利福平(500mg/只)后口服恩諾沙星（10 mg/kg.bw）組、單劑量靜注恩諾沙星(10 mg/kg.bw)組、單劑量口服維拉帕米后靜注恩諾沙星(10 mg/kg.bw)組以及單劑量口服利福平(500mg/只)后靜注恩諾沙星(10 mg/kg.bw)組。給藥后在不同時間點采血，采用HPLC

4、法測定血漿中恩諾沙星的藥物濃度。結果顯示:恩諾沙星的吸收速率常數(shù)Ka為1.38±0.31 h-1，達峰時間Tmax為1.78±0.18 h，血漿中峰濃度Cmax為1.97±0.24μg/mL，藥時曲線下面積AUC0-∞為14.54±1.03(μg/mL)*h。給予P-gp抑制劑維拉帕米后，口服恩諾沙星的峰濃度Cmax上升為2.3±0.37μg/mL(P=0.459)，藥時曲線下面積AUC0-∞極顯著上升為24.63±1.85(μg/mL

5、)*h(P=0.001)，達峰時間Tmax顯著提前為1.11±0.14 h（P=0.026），吸收速率Ka極顯著上升為2.98±0.29h-1（P=0.008），生物利用度增加了1.62倍，但維拉帕米對靜脈注射恩諾沙星的藥動學參數(shù)影響并不顯著;給予P-gp誘導劑利福平后，口服恩諾沙星的峰濃度Cmax極顯著下降為0.45±0.06μg/mL(P=0.002)，達峰時間Tmax延遲至5.32±1.15 h（P=0.011），藥時曲線下面積A

6、UC0-∞顯著降低為8.37±2.36(μg/mL)*h（P=0.036），吸收速率Ka顯著降低為0.38±0.1 h-1(P=0.029)，生物利用度下降1.64倍，同樣其對靜脈注射的恩諾沙星藥動學參數(shù)并未產(chǎn)生顯著影響。結果表明P-gp活性被調(diào)節(jié)后對肉雞體內(nèi)恩諾沙星的口服吸收過程會產(chǎn)生顯著影響，證實恩諾沙星為P-gp底物。
　　基于上述實驗結果，本論文進一步研究了大腸桿菌感染對肉雞組織中P-gp的功能和表達的影響。實驗選取10只

7、4周齡健康肉雞，隨機分為健康組和大腸桿菌感染組。處死后，采集肝臟、腎臟、十二指腸、空腸和回腸置于液氮中，后轉入-80℃冰箱保存。提取總RNA，反轉后，對Abcb1進行相對定量測定。結果顯示，與健康組相比，大腸桿菌感染之后Abcb1的表達量在各組織中都有所上調(diào)，其中在腎臟、空腸和回腸中差異顯著（P=0.032，P=0.017，P=0.046）。然后，我們采用免疫組化的方法，探究P-gp在健康和大腸桿菌感染肉雞肝臟、腎臟、十二指腸、空腸和回

8、腸的分布特點及表達差異。結果顯示，P-gp在肝臟主要定位于肝細胞之間的膽小管膜上，在腎臟主要定位于腎小管的細胞膜上，在小腸主要定位于小腸絨毛上皮細胞頂端。采用Imagepro-plus軟件進行半定量分析，比較P-gp在健康組和感染組表達量的差異。結果顯示，感染之后P-gp在肝臟和腎臟細胞內(nèi)的定位量有所上升，但是在細胞膜上的定位減少。P-gp在十二指腸中的表達量幾乎沒有變化，在空腸和回腸中表達量顯著上升(P＜0.05)。最后，我們使用HP

9、LC檢測了大腸桿菌感染前后恩諾沙星血藥濃度的變化情況，同時檢測P-gp抑制劑維拉帕米對雞口服恩諾沙星的藥動學影響。我們選用40只4周齡健康肉雞，隨機分為4組:(1)口服恩諾沙星健康組(2)口服恩諾沙星+維拉帕米(3)口服恩諾沙星感染組(4)口服恩諾沙星+維拉帕米感染組。結果表明，與健康組肉雞相比，感染會造成恩諾沙星的Cmax(P=0.000)和AUC0-12h(P=0.042)極顯著或顯著下降，Tmax顯著延長（P=0.040），T1/

10、2a和T1/2e顯著升高(P=0.045，P=0.000)，揭示著恩諾沙星的吸收被抑制。而用維拉帕米處理后，健康組和感染組中恩諾沙星的口服吸收增加，表現(xiàn)為峰濃度和AUC0-12h均顯著上升，達峰時間提前。該結果提示大腸桿菌感染可以引起肉雞組織中P-gp表達變化，進而影響口服恩諾沙星在肉雞體內(nèi)的吸收過程。
　　最后本論文初步探討了大腸桿菌感染對P-gp mRNA表達變化的調(diào)控機制。實驗比較了健康和感染肉雞中細胞因子（IL-6、IL-

11、1β和TNFα）以及轉錄因子如核受體(CXR)、NF-κB的mRNA表達差異，并分析其與Abcb1 mRNA表達變化的相關性。結果顯示，感染之后，IL-6在各組織中都有所上升，其中在肝臟差異顯著（P=0.023）;IL-1β在各組織中均有顯著的上升（肝臟P=0.018，腎臟P=0.022，十二指腸P=0.000，空腸P=0.001，回腸P=0.002）;TNFα在各組織中均有上升，其中在腎臟、空腸和回腸差異顯著（P=0.01，P=0.0

12、00，P=0.001）;CXR在各組織中均有上升，其中在十二指腸、空腸和回腸差異顯著（P=0.002，P=0.008，P=0.017）;NF-κB在各組織中均有上升，其中在空腸和回腸差異顯著（P=0.021，P=0.044）。分析調(diào)控因子的表達量變化與Abcb1表達水平變化的相關性，發(fā)現(xiàn)Abcb1的調(diào)控機制存在組織差異性，腎臟、空腸和回腸中Abcb1 mRNA表達的變化與CXR、TNFα/NF-κB通路呈顯著相關，可能受二者的共同調(diào)控，

13、另外空腸（r=0.813，P=0.000）和回腸（r=0.634，P=0.015）中Abcb1mRNA的表達量變化與IL-1β也呈顯著性相關。而IL-6與各組織中Abcb1表達量變化未呈現(xiàn)明顯的相關性。
　　綜上結果，大腸桿菌感染可導致肉雞組織中P-gp的表達上調(diào)，外排功能增強，可使恩諾沙星在腸道的吸收減少。大腸桿菌感染導致P-gp表達上調(diào)與核受體CXR、促炎性細胞因子TNFα、核轉錄因子NF-κB的變化密切相關，但其具體的調(diào)控機