影響粒單細胞系HL-60細胞功能的血糖水平的探討.pdf

1、背景與目的:新近研究發(fā)現糖尿病患者易患細菌感染、大血管并發(fā)癥以及微血管并發(fā)癥,這些均與中性粒細胞的數量和質量的改變有關。中性粒細胞是機體抗感染免疫的第一道防線,糖尿病時中性粒細胞的功能明顯受損,因此,中性粒細胞功能肯定受高血糖的影響。血糖控制在預防感染方面至關重要,但旨在研究危重病人血糖控制的NICE-SUGAR研究和預防糖尿病大血管事件的ACCORD研究均沒有發(fā)現實現血糖“正?；笨蓽p少全因死亡。但是,當前尚沒有研究探討糖尿病時血糖到

2、底控制在何種水平既安全、不影響中性粒細胞功能,又避免中性粒細胞在殺傷病原微生物的同時不對機體造成損傷。本實驗用人類早幼粒細胞性白血病細胞株(HL-60)細胞作為研究的模型,來研究不同血糖濃度狀態(tài)下胰島素濃度及外源性炎性因子脂多糖對中性粒細胞的吞噬功能和ROS的產生的影響,以找到適合臨床上血糖控制的安全范圍。
　　 方法:
　　 1.細胞培養(yǎng)
　　 人類早幼粒細胞性白血病細胞株HL-60(大連醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院實驗

3、室提供)。將HL-60細胞置入含有的10％胎牛血清的RPMI1640(5.0 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)液中,放置于37℃,5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)。并在對數生長期收獲細胞,使細胞達到同步化后加入不同的實驗處理因素。
　　 2.實驗分組
　　 1)本實驗分別用不同水平的葡萄糖濃度對HL-60細胞進行培養(yǎng)(3.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、15.0、20.0 mmol/L、其中設置20.0

4、mmol/L甘露醇作為滲透壓對照組),細胞于37℃,5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)72h后,收獲細胞。
　　 2)實驗各組細胞再分別用不同濃度的胰島素進行對抗(0 mIU/L、相當于生理濃度20 mIU/L、相當于應激濃度50 mIU/L、相當于高濃度胰島素1000 mIU/L),細胞于37℃,5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)24h后收獲細胞。
　　 3)HL-60細胞在160 nmol/L的12-豆蔻酰及13-乙酸,佛波醇(PMA)

5、誘導分化24h后,細胞具有吞噬能力,用于檢測吞噬功能。
　　 4)實驗各組細胞置于有外源性刺激因子LPS(10μg/ml)和無LPS(0μg/ml)的條件中,刺激8b后收獲細胞,檢測HL-60細胞的吞噬的功能和氧化應激ROS產生的多少情況并進行單因素方差分析和秩和檢驗,結果進行比較。
　　 結果:
　　 1.葡萄糖、LPS及胰島素對HL-60細胞吞噬能力的影響
　　 (1)HL-60細胞吞噬功能從葡萄糖5

6、.0 mmol/L起逐漸增強,至8.0 mmol/L達到高峰顯著增強(P＜0.05),至10.0 mmol/L回到基線水平。
　　 (2)培養(yǎng)液中存在10μg/ml脂多糖(LPS)時,HL-60細胞的吞噬功能在葡萄糖濃度為3.5 mmol/L時最強,與5.0 mmol/L葡萄糖時相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),葡萄糖濃度從5.0 mmol/L至20.0 mmol/L沒有觀察到對細胞吞噬功能的影響。
　　 (3)培養(yǎng)

7、液中加入不同濃度胰島素后,HL-60細胞的吞噬功能呈下降趨勢,且與胰島素濃度升高沒有明顯關系。胰島素能夠抑制葡萄糖引起的HL-60細胞吞噬功能增強。葡萄糖濃度為5.0～10.0 mmol/L時,胰島素對葡萄糖引起的細胞吞噬功能抑制最明顯(P＜0.05),而10.0 mmol/L葡萄糖以后細胞吞噬功能減弱的不明顯。
　　 (4)培養(yǎng)液中存在10μg/ml脂多糖(LPS)時,并在孵育葡萄糖的同時加入相當于生理濃度的胰島素(20 mI

8、U/L)、相當于應激濃度的胰島素(50 mIU/L)和相當于高胰島素(1000 mIU/L),與未加入胰島素時相比,炎癥因子存在能夠使HL-60細胞的吞噬功能增強,胰島素濃度對HL-60細胞的吞噬功能沒有明顯影響,但仍舊存在一定程度的抑制作用。
　　 2.葡萄糖、LPS及胰島素對HL-60細胞產生ROS的影響
　　 (1)HL-60細胞產生的ROS的能力從葡萄糖濃度5.0 mmol/L至20.0 mmol/L均沒有明顯改

9、變。
　　 (2)當培養(yǎng)液內有葡萄糖與10μg/ml脂多糖(LPS)共同培養(yǎng)時,HL-60細胞產生ROS的能力于各個葡萄糖濃度均顯著增加(P＜0.05)。
　　 (3)培養(yǎng)液中加入不同濃度胰島素時,HL-60細胞產生的ROS與未加入胰島素相比,相當于生理濃度胰島素(20 mIU/L)和相當于應激濃度胰島素(50 mIU/L)時,HL-60細胞產生的ROS沒有明顯影響,而高濃度胰島素(1000 mIU/L)可以明顯增加HL

10、-60細胞ROS的產生(P＜0.05)。
　　 (4)培養(yǎng)液中存在10μg/ml脂多糖(LPS)時,炎癥因子的存在能使HL-60細胞產生ROS明顯增加,孵育葡萄糖的同時加入相當于生理濃度的胰島素(20mIU/L)、中等濃度的胰島素(50 mIU/L)時,與未加入胰島素時相比,HL-60細胞產生的ROS沒有明顯增加,但加入高濃度胰島素(1000 mIU/L)時,HL-60細胞釋放的ROS明顯降低(P＜0.05),幾乎回到了未加入炎

11、癥因子LPS時的基線水平。
　　 結論:在相當于胰島素缺乏的條件下,中性粒細胞的吞噬功能血糖濃度5.0～10.0mmol/L時最強。在相當于無細菌感染的條件下,高胰島素血癥對中性粒細胞產生ROS無影響,但可以抑制血糖濃度5.0～10.0 mmol/L、胰島素缺乏情況下所觀察到的吞噬功能增強的作用。在相當于機體遭受感染及胰島素缺乏狀態(tài)下,中性粒細胞產生ROS的作用顯著增強,但其吞噬能力無改變;在生理及一般應激性胰島素條件下,中性粒