影響粒單細(xì)胞系HL-60細(xì)胞功能的血糖水平的探討.pdf

1、背景與目的:新近研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者易患細(xì)菌感染、大血管并發(fā)癥以及微血管并發(fā)癥,這些均與中性粒細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量的改變有關(guān)。中性粒細(xì)胞是機(jī)體抗感染免疫的第一道防線,糖尿病時(shí)中性粒細(xì)胞的功能明顯受損,因此,中性粒細(xì)胞功能肯定受高血糖的影響。血糖控制在預(yù)防感染方面至關(guān)重要,但旨在研究危重病人血糖控制的NICE-SUGAR研究和預(yù)防糖尿病大血管事件的ACCORD研究均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)血糖“正?；笨蓽p少全因死亡。但是,當(dāng)前尚沒(méi)有研究探討糖尿病時(shí)血糖到

2、底控制在何種水平既安全、不影響中性粒細(xì)胞功能,又避免中性粒細(xì)胞在殺傷病原微生物的同時(shí)不對(duì)機(jī)體造成損傷。本實(shí)驗(yàn)用人類早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株(HL-60)細(xì)胞作為研究的模型,來(lái)研究不同血糖濃度狀態(tài)下胰島素濃度及外源性炎性因子脂多糖對(duì)中性粒細(xì)胞的吞噬功能和ROS的產(chǎn)生的影響,以找到適合臨床上血糖控制的安全范圍。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 人類早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL-60(大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)

3、室提供)。將HL-60細(xì)胞置入含有的10％胎牛血清的RPMI1640(5.0 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)液中,放置于37℃,5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)。并在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收獲細(xì)胞,使細(xì)胞達(dá)到同步化后加入不同的實(shí)驗(yàn)處理因素。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分組
　　 1)本實(shí)驗(yàn)分別用不同水平的葡萄糖濃度對(duì)HL-60細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)(3.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、15.0、20.0 mmol/L、其中設(shè)置20.0

4、mmol/L甘露醇作為滲透壓對(duì)照組),細(xì)胞于37℃,5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)72h后,收獲細(xì)胞。
　　 2)實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞再分別用不同濃度的胰島素進(jìn)行對(duì)抗(0 mIU/L、相當(dāng)于生理濃度20 mIU/L、相當(dāng)于應(yīng)激濃度50 mIU/L、相當(dāng)于高濃度胰島素1000 mIU/L),細(xì)胞于37℃,5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)24h后收獲細(xì)胞。
　　 3)HL-60細(xì)胞在160 nmol/L的12-豆蔻酰及13-乙酸,佛波醇(PMA)

5、誘導(dǎo)分化24h后,細(xì)胞具有吞噬能力,用于檢測(cè)吞噬功能。
　　 4)實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞置于有外源性刺激因子LPS(10μg/ml)和無(wú)LPS(0μg/ml)的條件中,刺激8b后收獲細(xì)胞,檢測(cè)HL-60細(xì)胞的吞噬的功能和氧化應(yīng)激ROS產(chǎn)生的多少情況并進(jìn)行單因素方差分析和秩和檢驗(yàn),結(jié)果進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.葡萄糖、LPS及胰島素對(duì)HL-60細(xì)胞吞噬能力的影響
　　 (1)HL-60細(xì)胞吞噬功能從葡萄糖5

6、.0 mmol/L起逐漸增強(qiáng),至8.0 mmol/L達(dá)到高峰顯著增強(qiáng)(P＜0.05),至10.0 mmol/L回到基線水平。
　　 (2)培養(yǎng)液中存在10μg/ml脂多糖(LPS)時(shí),HL-60細(xì)胞的吞噬功能在葡萄糖濃度為3.5 mmol/L時(shí)最強(qiáng),與5.0 mmol/L葡萄糖時(shí)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),葡萄糖濃度從5.0 mmol/L至20.0 mmol/L沒(méi)有觀察到對(duì)細(xì)胞吞噬功能的影響。
　　 (3)培養(yǎng)

7、液中加入不同濃度胰島素后,HL-60細(xì)胞的吞噬功能呈下降趨勢(shì),且與胰島素濃度升高沒(méi)有明顯關(guān)系。胰島素能夠抑制葡萄糖引起的HL-60細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)。葡萄糖濃度為5.0～10.0 mmol/L時(shí),胰島素對(duì)葡萄糖引起的細(xì)胞吞噬功能抑制最明顯(P＜0.05),而10.0 mmol/L葡萄糖以后細(xì)胞吞噬功能減弱的不明顯。
　　 (4)培養(yǎng)液中存在10μg/ml脂多糖(LPS)時(shí),并在孵育葡萄糖的同時(shí)加入相當(dāng)于生理濃度的胰島素(20 mI

8、U/L)、相當(dāng)于應(yīng)激濃度的胰島素(50 mIU/L)和相當(dāng)于高胰島素(1000 mIU/L),與未加入胰島素時(shí)相比,炎癥因子存在能夠使HL-60細(xì)胞的吞噬功能增強(qiáng),胰島素濃度對(duì)HL-60細(xì)胞的吞噬功能沒(méi)有明顯影響,但仍舊存在一定程度的抑制作用。
　　 2.葡萄糖、LPS及胰島素對(duì)HL-60細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響
　　 (1)HL-60細(xì)胞產(chǎn)生的ROS的能力從葡萄糖濃度5.0 mmol/L至20.0 mmol/L均沒(méi)有明顯改

9、變。
　　 (2)當(dāng)培養(yǎng)液內(nèi)有葡萄糖與10μg/ml脂多糖(LPS)共同培養(yǎng)時(shí),HL-60細(xì)胞產(chǎn)生ROS的能力于各個(gè)葡萄糖濃度均顯著增加(P＜0.05)。
　　 (3)培養(yǎng)液中加入不同濃度胰島素時(shí),HL-60細(xì)胞產(chǎn)生的ROS與未加入胰島素相比,相當(dāng)于生理濃度胰島素(20 mIU/L)和相當(dāng)于應(yīng)激濃度胰島素(50 mIU/L)時(shí),HL-60細(xì)胞產(chǎn)生的ROS沒(méi)有明顯影響,而高濃度胰島素(1000 mIU/L)可以明顯增加HL

10、-60細(xì)胞ROS的產(chǎn)生(P＜0.05)。
　　 (4)培養(yǎng)液中存在10μg/ml脂多糖(LPS)時(shí),炎癥因子的存在能使HL-60細(xì)胞產(chǎn)生ROS明顯增加,孵育葡萄糖的同時(shí)加入相當(dāng)于生理濃度的胰島素(20mIU/L)、中等濃度的胰島素(50 mIU/L)時(shí),與未加入胰島素時(shí)相比,HL-60細(xì)胞產(chǎn)生的ROS沒(méi)有明顯增加,但加入高濃度胰島素(1000 mIU/L)時(shí),HL-60細(xì)胞釋放的ROS明顯降低(P＜0.05),幾乎回到了未加入炎

11、癥因子LPS時(shí)的基線水平。
　　 結(jié)論:在相當(dāng)于胰島素缺乏的條件下,中性粒細(xì)胞的吞噬功能血糖濃度5.0～10.0mmol/L時(shí)最強(qiáng)。在相當(dāng)于無(wú)細(xì)菌感染的條件下,高胰島素血癥對(duì)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生ROS無(wú)影響,但可以抑制血糖濃度5.0～10.0 mmol/L、胰島素缺乏情況下所觀察到的吞噬功能增強(qiáng)的作用。在相當(dāng)于機(jī)體遭受感染及胰島素缺乏狀態(tài)下,中性粒細(xì)胞產(chǎn)生ROS的作用顯著增強(qiáng),但其吞噬能力無(wú)改變;在生理及一般應(yīng)激性胰島素條件下,中性粒