游離的LIFRα胞內(nèi)功能片段對(duì)HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié).pdf

1、研究背景和目的:白血病抑制因子(LIF)是一種多效性細(xì)胞因子，作用于多種細(xì)胞組織發(fā)揮不同的生物學(xué)作用，廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化。如抑制胚胎干細(xì)胞的體外分化；刺激血小板生成，造血細(xì)胞增殖；促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖；促進(jìn)神經(jīng)原形成，肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，參與神經(jīng)肌肉修復(fù)；參與肝的急性期反應(yīng)，參與炎癥的生理病理過程等。這些生物學(xué)效應(yīng)有賴于其結(jié)合靶細(xì)胞膜上的LIF受體α亞基(gp190)，與另一亞基(gp130)形成異源性二聚體，激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通

2、路。gp190(LIFRα亞基)是低親和力的LIF特異性受體，屬于造血細(xì)胞素受體超家族，缺乏內(nèi)生激酶的活性。生理狀態(tài)下存在可溶性LIFR和跨膜LIFR?？扇苄允荏w，游離于胞外，無跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)，對(duì)LIF發(fā)揮的正常生理效應(yīng)有拮抗效應(yīng)?？缒IFR(gp190)胞內(nèi)區(qū)含三個(gè)功能域——BOX1、2、3。YXXQ序列位于遠(yuǎn)膜端(Y酪氨酸，X任意氨基酸，Q谷氨酰胺)，與STAT3的SH2位點(diǎn)特異性識(shí)別結(jié)合。細(xì)胞內(nèi)是否存在胞內(nèi)區(qū)游離受體，胞內(nèi)區(qū)受

3、體游離后如何影響信號(hào)傳遞，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)?有關(guān)膜受體信號(hào)啟動(dòng)位點(diǎn)的游離多肽對(duì)細(xì)胞增殖分化的影響已有報(bào)道，提示我們，單一亞基的單一信號(hào)啟動(dòng)位點(diǎn)在離膜狀態(tài)下完全能夠在細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。LIF信號(hào)傳導(dǎo)激活JAK-STAT途徑和RAS-MAPK途徑，我們前期研究根據(jù)gp190細(xì)胞內(nèi)區(qū)的不同功能域分別設(shè)計(jì)了兩種小分子——190CT2+3(含BOX2+3)和190CT3(含BOX3)，發(fā)現(xiàn)gp190細(xì)胞內(nèi)區(qū)的多個(gè)功能域成為游離多肽在細(xì)

4、胞內(nèi)存在時(shí)，對(duì)細(xì)胞分化有不同的影響，激活不同的信號(hào)分子。為進(jìn)一步驗(yàn)證前期工作，研究發(fā)生機(jī)制，本研究成功獲得了重組190CT2+3和190CT3兩種白血病HL-60細(xì)胞株，并進(jìn)一步對(duì)190CT3的YXXQ基團(tuán)定點(diǎn)突變研究相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)重組目的基因(190CT2+3和190CT3)的腫瘤細(xì)胞，增殖均受到抑制，促進(jìn)細(xì)胞成熟分化，JAK/STAT3通路激活；通過該研究，我們明確了gp190不同的功能域190CT2+3、190CT

5、3在胞內(nèi)游離存在時(shí)，對(duì)急性早幼粒白血病細(xì)胞HL-60增殖分化的功能效應(yīng)和相關(guān)信號(hào)通路；有利于探索受體細(xì)胞內(nèi)區(qū)單一功能域的應(yīng)用價(jià)值，以誘導(dǎo)干細(xì)胞同步定向分化，希望獲得一定數(shù)量的專能干細(xì)胞。 第一部分重組人LIFR胞內(nèi)游離片段的白血病HL-60細(xì)胞的獲得與鑒定方法：(1)酶切初步鑒定已構(gòu)建的重組質(zhì)粒PCDNA3.0-190CT2+3、PCDNA3.0-190CT3，進(jìn)一步測(cè)序；(2)將重組載體用FuGENE-6脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染白血病H

6、L-60細(xì)胞，含G-418完全培養(yǎng)基以梯度稀釋法篩選陽(yáng)性克隆15d，設(shè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.O空質(zhì)粒載體和野生型HL-60細(xì)胞為對(duì)照實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞LIFR目片段表達(dá)量的鑒定：挑選生長(zhǎng)旺盛的克隆，以免疫細(xì)胞化學(xué)，蛋白印跡法進(jìn)行蛋白水平的定量檢測(cè)，確定穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，以備后面實(shí)驗(yàn)使用。(3)觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，繪制生長(zhǎng)曲線；免疫印跡法檢測(cè)增殖核抗原PCNA；流式細(xì)胞儀檢測(cè)成熟粒細(xì)胞相關(guān)抗原CD15；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)STAT3。結(jié)果：(

7、1)BamHⅠ、XbaⅠ雙酶切，電泳紫外燈下觀察可見大小相符的目的片段，測(cè)序結(jié)果與Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中LIFR序列(X61615)比對(duì)，完全一致，已正確構(gòu)建重組人LIFR胞內(nèi)游離片段的真核表達(dá)質(zhì)粒。(2)經(jīng)G-418篩選重組190CT2+3、190CT3的HL-60細(xì)胞和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用免疫印跡法檢測(cè)LIFR，于20KD、15KD處見目的蛋白條帶，選取穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)LIFR表達(dá)，試驗(yàn)組胞質(zhì)陽(yáng)

8、性信號(hào)較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，同時(shí)試驗(yàn)組出現(xiàn)桿狀、分葉核，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析試驗(yàn)組分葉核比例，P＜0.05,組間差別有意義。(3)細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線，試驗(yàn)組(PCDNA3.0-190CT2+3、190CT3重組子HL-60細(xì)胞株)生長(zhǎng)速度較對(duì)照組(pcDNA3.0空質(zhì)粒載體和野生型HL-60細(xì)胞)明顯減慢；流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD15發(fā)現(xiàn),PCDNA3.0-190CT3重組子HL-60細(xì)胞株CD15陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)高于轉(zhuǎn)染PCDNA3.0-190CT2+

9、3組，且均高于對(duì)照組；免疫印跡法檢測(cè)兩組試驗(yàn)組PCNA均低于對(duì)照組；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)STAT3：試驗(yàn)組表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)。結(jié)論：(1)將190CT2+3、190CT3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，用G-418篩選，單克隆培養(yǎng)，經(jīng)檢測(cè)說明重組HL-60細(xì)胞株已經(jīng)穩(wěn)定表達(dá)目的基因。(2)試驗(yàn)組分葉核的比例增加，生長(zhǎng)減慢，CD15表達(dá)的增高和PCDA表達(dá)的降低，初步證明目的基因?qū)L-60細(xì)胞有促進(jìn)分化，抑制增殖的作用；同時(shí)信號(hào)分子STAT3激活

10、。 第二部分人LIFR胞內(nèi)游離片段信號(hào)通路的檢測(cè)方法：(1)190CT3點(diǎn)突變體的HL-60白血病細(xì)胞株的獲得與鑒定：通過引物延伸法設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變，將190CT3蛋白序列中三處YXXQ基團(tuán)的酪氨酸位點(diǎn)突變?yōu)楸奖彼?，?gòu)建重組表達(dá)載體pcDNA3.0-MUT。將重組質(zhì)粒用FuGENE-6脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，G-418梯度篩選陽(yáng)性克隆，挑選生長(zhǎng)旺盛的克隆，以RT-PCR方法進(jìn)行mRNA的半定量檢測(cè)，確定表達(dá)量較高的細(xì)胞株。(2)

11、免疫印跡法檢測(cè)五組HL-60細(xì)胞株中信號(hào)分子STAT3、磷酸化STAT3(T705)，JAK1，P44/42(P44/42MAPK)。(3)免疫熒光法檢測(cè)信號(hào)分子STAT3和磷酸化STAT3(T705)。結(jié)果：(1)點(diǎn)突變PCR后獲得339bpDNA片段，經(jīng)BamHⅠ、XbaⅠ雙酶切連接重組入質(zhì)粒pcDNA3.0，雙向測(cè)序后與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中LIFR序列(X61615)比對(duì)，插入片段的三處編碼酪氨酸的cDNA序列TAT正確置換為編

12、碼苯丙氨酸的TTC，我們成功獲得重組pcDNA3.0-MUT的真核表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)G-418篩選出4株重組190CT3突變體的細(xì)胞株，用RT-PCR方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)，選取表達(dá)量較高的細(xì)胞株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。(2)免疫印跡法檢測(cè)信號(hào)分子的蛋白表達(dá)，試驗(yàn)組PCDNA3.0-190CT2+3、PCDNA3.0-190CT3重組子HL-60細(xì)胞株中STAT3和磷酸化STAT3明顯較對(duì)照組增高，突變組表達(dá)較弱同時(shí)JAK1未見表達(dá)，P44/42的檢

13、測(cè)表達(dá)情況相反，試驗(yàn)組表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低。(3)免疫熒光法觀測(cè)到試驗(yàn)組STAT3表達(dá)胞質(zhì)熒光增強(qiáng)，試驗(yàn)組磷酸化STAT3胞核熒光增強(qiáng)；結(jié)論：(1)我們以190CT3基因片段為來源，用特異性的引物進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到重組pcDNA3.0-MUT的真核表達(dá)質(zhì)粒。將重組體轉(zhuǎn)染進(jìn)入HL-60細(xì)胞，用G-418篩選，經(jīng)檢測(cè)說明重組的HL-60細(xì)胞株已經(jīng)穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.0-MUT，為以下的實(shí)驗(yàn)提供了準(zhǔn)確、有效的實(shí)驗(yàn)工具。(2)目的片段190