游離的LIFRα胞內(nèi)功能片段對HL-60細胞的生長調(diào)節(jié).pdf

1、研究背景和目的:白血病抑制因子(LIF)是一種多效性細胞因子，作用于多種細胞組織發(fā)揮不同的生物學作用，廣泛調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖和分化。如抑制胚胎干細胞的體外分化；刺激血小板生成，造血細胞增殖；促進成骨細胞增殖；促進神經(jīng)原形成，肌肉衛(wèi)星細胞的增殖，參與神經(jīng)肌肉修復；參與肝的急性期反應，參與炎癥的生理病理過程等。這些生物學效應有賴于其結合靶細胞膜上的LIF受體α亞基(gp190)，與另一亞基(gp130)形成異源性二聚體，激活下游信號轉(zhuǎn)導通

2、路。gp190(LIFRα亞基)是低親和力的LIF特異性受體，屬于造血細胞素受體超家族，缺乏內(nèi)生激酶的活性。生理狀態(tài)下存在可溶性LIFR和跨膜LIFR?？扇苄允荏w，游離于胞外，無跨膜區(qū)和細胞內(nèi)區(qū)，對LIF發(fā)揮的正常生理效應有拮抗效應。跨膜LIFR(gp190)胞內(nèi)區(qū)含三個功能域——BOX1、2、3。YXXQ序列位于遠膜端(Y酪氨酸，X任意氨基酸，Q谷氨酰胺)，與STAT3的SH2位點特異性識別結合。細胞內(nèi)是否存在胞內(nèi)區(qū)游離受體，胞內(nèi)區(qū)受

3、體游離后如何影響信號傳遞，發(fā)揮其生物學效應?有關膜受體信號啟動位點的游離多肽對細胞增殖分化的影響已有報道，提示我們，單一亞基的單一信號啟動位點在離膜狀態(tài)下完全能夠在細胞內(nèi)啟動相應的信號轉(zhuǎn)導通路。LIF信號傳導激活JAK-STAT途徑和RAS-MAPK途徑，我們前期研究根據(jù)gp190細胞內(nèi)區(qū)的不同功能域分別設計了兩種小分子——190CT2+3(含BOX2+3)和190CT3(含BOX3)，發(fā)現(xiàn)gp190細胞內(nèi)區(qū)的多個功能域成為游離多肽在細

4、胞內(nèi)存在時，對細胞分化有不同的影響，激活不同的信號分子。為進一步驗證前期工作，研究發(fā)生機制，本研究成功獲得了重組190CT2+3和190CT3兩種白血病HL-60細胞株，并進一步對190CT3的YXXQ基團定點突變研究相關信號轉(zhuǎn)導通路，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達重組目的基因(190CT2+3和190CT3)的腫瘤細胞，增殖均受到抑制，促進細胞成熟分化，JAK/STAT3通路激活；通過該研究，我們明確了gp190不同的功能域190CT2+3、190CT

5、3在胞內(nèi)游離存在時，對急性早幼粒白血病細胞HL-60增殖分化的功能效應和相關信號通路；有利于探索受體細胞內(nèi)區(qū)單一功能域的應用價值，以誘導干細胞同步定向分化，希望獲得一定數(shù)量的專能干細胞。 第一部分重組人LIFR胞內(nèi)游離片段的白血病HL-60細胞的獲得與鑒定方法：(1)酶切初步鑒定已構建的重組質(zhì)粒PCDNA3.0-190CT2+3、PCDNA3.0-190CT3，進一步測序；(2)將重組載體用FuGENE-6脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染白血病H

6、L-60細胞，含G-418完全培養(yǎng)基以梯度稀釋法篩選陽性克隆15d，設轉(zhuǎn)染pcDNA3.O空質(zhì)粒載體和野生型HL-60細胞為對照實驗細胞。轉(zhuǎn)染組細胞LIFR目片段表達量的鑒定：挑選生長旺盛的克隆，以免疫細胞化學，蛋白印跡法進行蛋白水平的定量檢測，確定穩(wěn)定表達的細胞株，以備后面實驗使用。(3)觀察各組細胞生長狀態(tài)，繪制生長曲線；免疫印跡法檢測增殖核抗原PCNA；流式細胞儀檢測成熟粒細胞相關抗原CD15；免疫細胞化學檢測STAT3。結果：(

7、1)BamHⅠ、XbaⅠ雙酶切，電泳紫外燈下觀察可見大小相符的目的片段，測序結果與Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫中LIFR序列(X61615)比對，完全一致，已正確構建重組人LIFR胞內(nèi)游離片段的真核表達質(zhì)粒。(2)經(jīng)G-418篩選重組190CT2+3、190CT3的HL-60細胞和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，用免疫印跡法檢測LIFR，于20KD、15KD處見目的蛋白條帶，選取穩(wěn)定表達的細胞株進行下一步實驗。免疫細胞化學檢測LIFR表達，試驗組胞質(zhì)陽

8、性信號較對照組明顯增強，同時試驗組出現(xiàn)桿狀、分葉核，統(tǒng)計學分析試驗組分葉核比例，P＜0.05,組間差別有意義。(3)細胞計數(shù)，繪制生長曲線，試驗組(PCDNA3.0-190CT2+3、190CT3重組子HL-60細胞株)生長速度較對照組(pcDNA3.0空質(zhì)粒載體和野生型HL-60細胞)明顯減慢；流式細胞儀檢測CD15發(fā)現(xiàn),PCDNA3.0-190CT3重組子HL-60細胞株CD15陽性細胞百分數(shù)高于轉(zhuǎn)染PCDNA3.0-190CT2+

9、3組，且均高于對照組；免疫印跡法檢測兩組試驗組PCNA均低于對照組；免疫細胞化學檢測STAT3：試驗組表達較對照組增強。結論：(1)將190CT2+3、190CT3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HL-60細胞，用G-418篩選，單克隆培養(yǎng)，經(jīng)檢測說明重組HL-60細胞株已經(jīng)穩(wěn)定表達目的基因。(2)試驗組分葉核的比例增加，生長減慢，CD15表達的增高和PCDA表達的降低，初步證明目的基因?qū)L-60細胞有促進分化，抑制增殖的作用；同時信號分子STAT3激活

10、。 第二部分人LIFR胞內(nèi)游離片段信號通路的檢測方法：(1)190CT3點突變體的HL-60白血病細胞株的獲得與鑒定：通過引物延伸法設計定點突變，將190CT3蛋白序列中三處YXXQ基團的酪氨酸位點突變?yōu)楸奖彼?，構建重組表達載體pcDNA3.0-MUT。將重組質(zhì)粒用FuGENE-6脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HL-60細胞，G-418梯度篩選陽性克隆，挑選生長旺盛的克隆，以RT-PCR方法進行mRNA的半定量檢測，確定表達量較高的細胞株。(2)

11、免疫印跡法檢測五組HL-60細胞株中信號分子STAT3、磷酸化STAT3(T705)，JAK1，P44/42(P44/42MAPK)。(3)免疫熒光法檢測信號分子STAT3和磷酸化STAT3(T705)。結果：(1)點突變PCR后獲得339bpDNA片段，經(jīng)BamHⅠ、XbaⅠ雙酶切連接重組入質(zhì)粒pcDNA3.0，雙向測序后與Genbank數(shù)據(jù)庫中LIFR序列(X61615)比對，插入片段的三處編碼酪氨酸的cDNA序列TAT正確置換為編

12、碼苯丙氨酸的TTC，我們成功獲得重組pcDNA3.0-MUT的真核表達質(zhì)粒。經(jīng)G-418篩選出4株重組190CT3突變體的細胞株，用RT-PCR方法檢測目的基因的表達，選取表達量較高的細胞株進行下一步實驗。(2)免疫印跡法檢測信號分子的蛋白表達，試驗組PCDNA3.0-190CT2+3、PCDNA3.0-190CT3重組子HL-60細胞株中STAT3和磷酸化STAT3明顯較對照組增高，突變組表達較弱同時JAK1未見表達，P44/42的檢

13、測表達情況相反，試驗組表達量較對照組明顯降低。(3)免疫熒光法觀測到試驗組STAT3表達胞質(zhì)熒光增強，試驗組磷酸化STAT3胞核熒光增強；結論：(1)我們以190CT3基因片段為來源，用特異性的引物進行定點突變，得到重組pcDNA3.0-MUT的真核表達質(zhì)粒。將重組體轉(zhuǎn)染進入HL-60細胞，用G-418篩選，經(jīng)檢測說明重組的HL-60細胞株已經(jīng)穩(wěn)定表達pcDNA3.0-MUT，為以下的實驗提供了準確、有效的實驗工具。(2)目的片段190