先天性黑蒙癥致病基因Nmnat1復合雜合突變小鼠各組織中nmnat1與sirt1基因表達研究和SMN1基因新突變導致脊髓性肌萎縮癥.pdf

1、本文分為兩個部分進行探討：
　　第一部分 先天性黑蒙癥致病基因Nmnat1復合雜合突變小鼠各組織中nmnat1與sirt1基因表達
　　背景:先天性黑蒙癥(Leber's congenital amaurosis,LCA)是一類導致視網膜病變的眼部疾病,患兒一般在出生時或出生一年后呈現嚴重的視力障礙。該病多是常染色體隱形遺傳病,目前研究報道了約18種與先天性黑蒙相關的致病基因。本課題組通過高通量測序和外顯子捕獲技術,發(fā)現了N

2、MNAT1基因突變會導致9型先天性黑蒙癥發(fā)生。NMNAT1基因通過編碼一類催化NAD+合成的關鍵酶類—煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉移酶,參與NAD+依賴的多種代謝過程。SIRT1是一類NAD+依賴的去乙酰化酶,可進行NAD+依賴性的去乙?；磻?并參與代謝疾病,惡性腫瘤,心血管疾病以及神經性疾病等多種疾病的調節(jié)機制。研究報道顯示,NMNAT1基因可與SIRT1直接相互作用,將NAD+轉移至SIRT1,從而發(fā)揮去乙?；δ?。由此可見,NMNAT

3、1蛋白與SIRT1蛋白之間是緊密聯(lián)系的。
　　目的:研究發(fā)現NMNAT1蛋白在多種組織中廣泛表達,其中在視網膜,肝臟,睪丸,骨骼肌等組織中表達量較高。本文通過選取NMNAT1基因突變(c.769G＞A和c.454G＞T)位點敲入小鼠來研究NMNAT1與SIRT1在成年突變小鼠全身各組織臟器中表達水平的差異和組織學水平的異常。以期了解NMNAT1基因突變對除眼睛外其它組織的損傷情況。
　　方法:建立NMNAT1基因(c.769

4、G＞A和c.454G＞T)復合雜合突變的小鼠模型。小鼠出生一周后剪取尾巴或腳趾提取基因組DNA,通過Sanger測序驗證小鼠基因型。NMNAT1基因(c.769G＞A和c.454G＞T)復合雜合突變小鼠和對照組同時培育至20周(之前實驗室研究發(fā)現20周老鼠黑蒙癥表型最為嚴重),解剖收集各組織獲取組織RNA,并通過熒光定量PCR技術檢測小鼠各組織RNA表達水平的差異。選取差異較大的組織,運用免疫組化檢測蛋白表達位置及水平變化,HE染色結果

5、觀察相應組織細胞是否有形態(tài)學病理學上的病變結果:NMNAT1基因(c.769G＞A和c.454G＞T)復合雜合突變小鼠的NMNAT1和SIRT1基因在肝臟和睪丸的組織的表達量明顯下調,并表現出顯著的統(tǒng)計學差異,在其他組織包括眼睛,肌肉,心臟,腎臟等中沒有顯著差異。免疫組化結果同樣顯示突變小鼠NMNAT1和SIRT1表達水平下調。HE染色結果表明突變小鼠的睪丸和肝臟組織形態(tài)學結構改變。
　　結論:先天性黑蒙癥致病基因NMNAT1(c

6、.769G＞A和c.454G＞T)復合雜合突變除了對于視網膜造成嚴重損傷外,同時會對于肝臟組織和睪丸組織帶來一定程度的損傷,這兩個組織的嚴重損傷可能是由于NMNAT1基因突變引起SIRT1表達異常所導致。
　　第二部分 SMN1基因新發(fā)突變導致脊髓性肌萎縮癥(SMA)
　　背景:脊髓性肌萎縮(Spinal muscular atrophy, SMA)是一類常染色體隱性遺傳病,常伴隨有運動神經元的退行,骨骼肌的萎縮以普遍的肌肉

7、無力。該病主要由于神經元存活基因(Survival motor neuronl,SMN1)發(fā)生缺失或突變所導致。
　　目的:在本研究中我們收集了3個脊髓性肌萎縮癥的患病家系,通過多種篩查手段探測家系中的先證者致病信息以及攜帶者信息,為這些家系后期的遺傳咨詢和產前診斷提供臨床實驗室依據。
　　方法:采集先證者以及先證者親屬外周血樣并獲取全基因組DNA,運用熒光定量PCR技術進行SMN1基因拷貝數篩查。全血RNA提取并反轉錄為c

8、DNA,通過設計合適引物和Sanger測序檢測家系中的致病點突變。質粒構建以及后續(xù)的細胞實驗驗證點突變造成SMN蛋白定位和功能上的改變,并結合生物信息學來說明點突變導致蛋白結構異常以及致病性。
　　結果:發(fā)現了一個SMN1基因新的突變位點c.728_729delTT(p.Ile243Thrfs 12),該突變會導致第243位氨基酸從異亮氨酸轉變?yōu)樘K氨酸并且提前終止形成截短蛋白。細胞定位實驗表明該突變會造成SMN蛋白定位異常。再結合

9、蛋白功能預測分析結果確定突變c.728 729delTT為致病突變。另外,在篩查一個家系的攜帶者時發(fā)現了中國家庭中罕見的“2+0”模式(即一條染色體上帶有2個SMN1基因,另一條染色體上沒有SMN1)。最后一個家系的先證者為常見的SMN1基因7號外顯子缺失。
　　結論:本課題組發(fā)現了一個未曾被報道過的SMN1基因新發(fā)突變c.728_729delTT(p.Ile243Thrfs12),經過細胞學實驗驗證以及生物信息分析均表明該突變?yōu)?/p>