新型STAT3抑制劑K9抗多發(fā)性骨髓瘤的機理研究.pdf

1、目的：STAT3即信號傳導和轉錄激活因子3，是調節(jié)細胞內一系列基因表達的重要轉錄因子，在細胞凋亡和細胞周期等細胞生理過程中發(fā)揮著重要的作用。在多發(fā)性骨髓瘤中，STAT3被異常激活而失調，同時與臨床上骨髓瘤病人的不良預后和耐藥密切相關。目前，靶向STAT3信號通路來設計相關STAT3抑制劑已成為抗骨髓瘤藥物研發(fā)的新策略之一。本研究旨在通過高通量篩選方法發(fā)現新的STAT3抑制劑，并闡釋其抗骨髓瘤的作用機制，為臨床上靶向藥物治療多發(fā)性骨髓瘤提

2、供參考。
　　方法：⑴利用基于熒光素酶報告基因的高通量篩選方法，從56,000個小分子化合物中尋找新型STAT3抑制劑。⑵通過Immunoblotting技術和流式細胞技術，檢測K9對多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)細胞凋亡的影響。⑶通過構建裸鼠腫瘤異體移植模型，分析K9對體內腫瘤生長的影響。⑷使用Immunoblotting技術，檢測K9對MM細胞本底以及IL-6所誘導的STAT3磷酸化的影響；同時，通過M

3、M細胞與骨髓基質細胞共培養(yǎng)實驗，檢測K9對STAT3磷酸化的影響。⑸分別通過Immunoblotting技術、分子對接和體外酶活性測定方法，分析K9對STAT3上游各激酶活性的影響。⑹利用免疫共沉淀法和熒光素酶報告基因技術，檢測K9對STAT3二聚化以及轉錄活性的影響。⑺RT-PCR和Immunoblotting技術分析K9對STAT3靶基因MCL1和XIAP轉錄表達的影響。⑻通過IL-6刺激實驗和STAT3過表達實驗，考察過度激活或過

4、表達STAT3是否影響K9所誘導的MM細胞凋亡。⑼K9與阿霉素(DOX)進行聯合用藥，考察K9是否影響DOX的抗腫瘤活性。
　　結果：①通過高通量篩選和前期實驗，發(fā)現化合物K9為候選的STAT3抑制劑。②Immunoblotting分析發(fā)現，K9能夠促進MM細胞(NCI-H929、KMS12、OCI-My5、RPMI-8226和U266)中凋亡相關蛋白PARP和Caspase3的剪切，進一步通過流式細胞分析技術發(fā)現，K9能夠誘導M

5、M細胞凋亡。③K9能夠抑制腫瘤異體移植模型中骨髓瘤的生長。同時，通過測定裸鼠體重發(fā)現，給藥組與對照組體重沒有差別。另外，通過血液分析發(fā)現，給藥組中WBC、RBC、HGB和PLT與對照組相比無顯著差異，這些結果提示，K9在體內的毒性較小。④STAT3在5種MM細胞中異常激活。同時，K9能夠有效抑制MM細胞中本底或者IL-6所誘導的STAT3的活化，而對STAT家族其它蛋白STAT1和STAT5的活化基本沒有影響。另外，MM細胞與骨髓基質細

6、胞共培養(yǎng)條件下，K9依然能夠抑制STAT3的活化。⑤K9通過特異性抑制STAT3信號通路上游激酶JAK2的活化來抑制STAT3信號通路，而對其它相關激酶的活化沒有影響，包括mTOR、P38、ERK和c-Src等。另外，分子對接實驗發(fā)現，K9能夠很好地結合到 JAK2的活性口袋中，并能有效抑制JAK2的活化。⑥K9能夠有效抑制STAT3驅動的pSTAT3-Luc熒光素酶活性，同時K9也能顯著抑制STAT3下游靶基因CCND2的啟動子活性，

7、而對不含有STAT3結合單元的熒光素酶活性沒有影響。另外，K9對另一重要的轉錄因子NFκB所驅動的熒光素酶活性也沒有影響。同時，Co-IP結果顯示，K9能夠有效抑制STAT3的二聚化。⑦RT-PCR和Immunoblotting技術分析發(fā)現，K9顯著抑制STAT3下游靶基因MCL1和XIAP的轉錄表達。⑧IL-6所誘導的STAT3的活化能夠部分抑制K9所誘導的MM細胞的凋亡；同時，過表達STAT3后發(fā)現，其也能減弱K9對MM細胞的敏感性